劉建民,呂景芳,王華,劉靜,陳明揚(yáng),王靜芝

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

“雙固一通”電針?lè)▽?duì)老年陽(yáng)虛證模型大鼠肝線粒體結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響

劉建民1,呂景芳2,王華1,劉靜3,陳明揚(yáng)4,王靜芝1

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢430061;2.十堰市婦幼保健院,十堰 442000;3.孝感市中心醫(yī)院,孝感 432000;4. 武漢市中醫(yī)醫(yī)院,武漢 430010)

目的探討“雙固一通”電針?lè)▽?duì)老年陽(yáng)虛證模型大鼠肝線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響。方法選用5月齡SD雄性大鼠40只,隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組,每組10只。A組為正常對(duì)照組,其余3組大鼠均皮下注射D-半乳糖40 d后再肌肉注射氫化可的松7 d制作老年陽(yáng)虛證大鼠模型。C組采用“雙固一通”電針?lè)?電針關(guān)元、足三里、百會(huì)穴;D組采用電針中極、陰陵泉、印堂穴治療。每星期治療6次,共治療4星期。治療后以游泳力竭時(shí)間判定各組大鼠抗疲勞能力,并采用透射電鏡觀察肝線粒體結(jié)構(gòu)、比色法檢測(cè)各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。結(jié)果與A組比較,B組和D組大鼠平均游泳力竭時(shí)間明顯縮短(均P＜0.01),肝線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,肝線粒體出現(xiàn)腫脹等改變,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降(P＜0.01,P＜0.05)。C組比B組游泳力竭時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01),肝線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)得到明顯改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯提高(P＜0.01,P＜0.05);D組與B組比較,大鼠平均游泳力竭時(shí)間縮短(P＜0.05),肝粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒,肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P＜0.05)。結(jié)論“雙固一通”電針?lè)筛纳评夏觋?yáng)虛證模型大鼠陽(yáng)虛抗疲勞能力,改善肝線粒體超微結(jié)構(gòu),提高肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,促進(jìn)肝臟能量代謝。

針刺療法;電針;陽(yáng)虛證;肝線粒體;ATP酶;“雙固一通”電針?lè)?大鼠

陽(yáng)虛是指機(jī)體陽(yáng)氣虧虛及其溫煦、推動(dòng)、興奮等功能減退而表現(xiàn)為虛寒內(nèi)生、精神萎靡、活動(dòng)減少、代謝低下等功能抑制的病理狀態(tài)[1-2]。近年來(lái),有學(xué)者通過(guò)對(duì)陽(yáng)虛證的研究表明[3-4],陽(yáng)虛證與機(jī)體能量代謝紊亂密不可分。筆者前期研究表明,“雙固一通”電針對(duì)老年陽(yáng)虛證模型大鼠在免疫調(diào)控方面以及肝線粒體呼吸功能方面均有顯著改善效應(yīng)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)探討“雙固一通”電針對(duì)老年陽(yáng)虛證模型大鼠肝線粒體結(jié)構(gòu)及ATP酶活性的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LKB-V型超薄切片機(jī)(瑞典BROMMA公司);日立H-600型透射電鏡(日本日立公司);721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(上海科大);DH 3600 AB電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司);無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS LH202H型電針儀(北京華威有限公司)。

水合氯醛為國(guó)產(chǎn)分析純;ATP酶測(cè)試盒(生產(chǎn)批號(hào)20120428,南京建成生物工程研究所);考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(Aidlab,北京)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為5月齡Sprague Dawley健康雄性大鼠,40只,清潔級(jí),體重為200～230 g,購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0004]。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于較為恒定的動(dòng)物飼養(yǎng)室(溫度為18℃～25℃,濕度為45%～55%),動(dòng)物可自由攝食和飲水。根據(jù)簡(jiǎn)單隨機(jī)排序法隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組,每組10只。

1.3 老年陽(yáng)虛證模型制作

參考黃兆勝制作阿爾茨海默病腎陽(yáng)虛模型[7]及課題前期實(shí)驗(yàn)中老年陽(yáng)虛證模型[5]制作,大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后,開始造模,除D組外,其余各組大鼠均連續(xù)40 d按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖給予頸背部皮下注射,之后連續(xù)7 d再行后腿肌肉注射氫化可的松1.5 mg/100 g,D組每日皮下注射等量0.9%生理鹽水1次,連續(xù)47 d。造模成功后的大鼠出現(xiàn)拱背蜷曲、肢尾冷、擠臥一起,被毛蓬松、失去光澤,足趾浮腫,舌淡胖苔潤(rùn),神疲、少食、反應(yīng)遲鈍、小便多等虛損狀。根據(jù)中醫(yī)陽(yáng)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)[8],類似“陽(yáng)虛”狀態(tài)。

1.4 處理方法

1.4.1 A組

正常飼養(yǎng)(以下各組略),不進(jìn)行造模及電針治療。

1.4.2 B組

造模,不予電針治療。

1.4.3 C組

造模成功后,參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》,取關(guān)元、足三里和百會(huì)。穴區(qū)剪毛備皮,75%醫(yī)用乙醇常規(guī)消毒,用0.35 mm×25 mm不銹鋼毫針針刺,關(guān)元直刺3～5 mm,雙側(cè)后三里直刺3～5 mm,百會(huì)向后平刺5 mm。其中關(guān)元與足三里接HANS LH202H型電針儀,雙側(cè)足三里與關(guān)元隔日交替接1對(duì)電極,選用連續(xù)波,頻率為2 Hz,強(qiáng)度為1 mA,通電15 min。每日上午9～11時(shí)治療1次,每星期治療6次,共治療4星期。

1.4.4 D組

造模完成后第2天,取中極、陰陵泉、印堂進(jìn)行電針治療處理,操作方法及療程同A組。

A組和B組相同方法、相同時(shí)間段內(nèi)抓取固定。各組大鼠治療及游泳力竭試驗(yàn)結(jié)束后,禁食,于第2天取材,進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 游泳力竭試驗(yàn)

各組大鼠于末次治療后進(jìn)行游泳力竭試驗(yàn)。采用負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)方式[9],泳池水深30 cm,水溫保持在(26 ±1)℃,每0.2 m2水面同時(shí)放4～5只大鼠游泳,游泳時(shí)避免大鼠互相抓抱或者趴于池壁休息,當(dāng)大鼠游泳動(dòng)作明顯不協(xié)調(diào),然后沉入水中10 s以上不能浮出時(shí)視為力竭。從大鼠入水開始計(jì)時(shí),至大鼠力竭停止,記錄每只大鼠力竭潛伏時(shí)間。

1.5.2 肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

將大鼠腹腔麻醉,頸部脫臼處死,迅速剖開腹腔取出肝組織,剪下約1 mm3肝組織塊,放入2.5%戊二醛中固定2 h后送至武漢大學(xué)電鏡室,透射電鏡觀察肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.3 肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測(cè)

另取肝組織塊約0.5 g,分成若干份,在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干。將肝組織塊稱重后置于勻漿器中,按1:9的比例加入0.9%的冷生理鹽水制成10%的勻漿液。將制備好的組織勻漿液轉(zhuǎn)入離心管,置冷凍離心機(jī),4℃以2000 r/min離心15 min。取上清液裝入樣品管中-20℃冷藏備用。肝組織蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。具體操作按各試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析,組間比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠平均游泳力竭時(shí)間比較

由表1可見,B組和D組大鼠平均游泳力竭較A組明顯縮短(P＜0.01);經(jīng)“雙固一通”電針處理的C組大鼠平均游泳力竭時(shí)間與B組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而D組游泳力竭時(shí)間雖較B組延長(zhǎng),但與C組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠平均游泳力竭時(shí)間比較 (±s,min)

表1 各組大鼠平均游泳力竭時(shí)間比較 (±s,min)

注:與A組比較1)P＜0.01;與B組比較2)P＜0.01;與C組比較3)P＜0.05

組別 n 平均游泳力竭時(shí)間A組 10 94.64±6.31 B組 10 67.72±7.211)C組 10 88.27±7.602)D組 10 76.49±6.591)3)

2.2 電鏡觀察肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

各組大鼠肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)見圖1。A組線粒體內(nèi)外膜清晰,線粒體嵴完整可見(圖1-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富且無(wú)脫顆?，F(xiàn)象(圖1-2)。B組線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,線粒體出現(xiàn)腫脹融合等改變(圖2-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少(圖2-2)。C組線粒體數(shù)目較B組增多,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,膜清晰,嵴完整(圖3-1),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯改變(圖3-2)。D組線粒體形態(tài)清楚(圖4-1),但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒(圖4-2)。

圖1 各組大鼠肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較

采用定磷法按照ATP酶試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,ATP酶活性以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位表示,即μmolPi/mgprot/h。計(jì)算公示為,ATP酶活性＝[(測(cè)定管吸光度－空白管吸光度)/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度]×標(biāo)準(zhǔn)濃度(1 μmol/mL) ×[(樣本稀釋倍數(shù)×6)/蛋白濃度]。

由表2可見,A組大鼠Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于B組(P＜0.05,P＜0.01)。與B組比較,C組Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯提高,兩組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05, P＜0.01)。D組Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均低于C組,兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

3 討論

肝臟是能量代謝的重要器官,線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化產(chǎn)生ATP以供能的主要場(chǎng)所。Na+-K+-ATP酶是維持線粒體膜水鈉平衡的關(guān)鍵物質(zhì),Ca2+-Mg2+-ATP酶是維持細(xì)胞內(nèi)鈣鎂平衡的重要物質(zhì),其生理作用均需通過(guò)分解ATP來(lái)實(shí)現(xiàn)[10],ATP酶活性是衡量線粒體能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)。研究表明[11-12],細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超載與機(jī)體的老年性疾病密切相關(guān),而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性是Ca2+分布的基礎(chǔ),線粒體的結(jié)構(gòu)破壞與功能抑制,將使老年機(jī)體處于代謝紊亂狀態(tài)[13]。老年陽(yáng)虛者畏寒怕冷、疲乏無(wú)力、多種代謝功能低下,與肝臟線粒體功能低下密切相關(guān)。為了從行為學(xué)方面反映電針對(duì)陽(yáng)虛證的改善效果,在實(shí)驗(yàn)中借鑒以往研究[14]引入游泳力竭試驗(yàn),結(jié)果表明,老年陽(yáng)虛模型大鼠平均游泳力竭時(shí)間較正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.01);而通過(guò)“雙固一通”電針治療能明顯延長(zhǎng)大鼠游泳力竭時(shí)間(P＜0.01),提示“雙固一通”電針能改善老年陽(yáng)虛模型大鼠陽(yáng)虛癥狀。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),老年陽(yáng)虛證模型大鼠肝線粒體內(nèi)外膜模糊不清,嵴變形、斷裂或消失,線粒體腫脹融合;采用定磷法檢測(cè)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯降低,表明機(jī)體處于陽(yáng)虛供能不足、能量代謝低下狀態(tài)。經(jīng)“雙固一通”電針治療后大鼠線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)得到改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯升高。提示“雙固一通”電針?lè)芨纳聘渭?xì)胞受損狀態(tài),促進(jìn)ATP合成與分解,使肝細(xì)胞處于能量代謝活躍狀態(tài)。

《靈樞?天年》:“五十歲,肝氣始衰,肝葉始薄,膽汁始減,目始不明。六十歲,心氣始衰,苦憂悲,血?dú)庑笁?故好臥。七十歲,脾氣虛,皮膚枯。八十歲,肺氣衰,魄離,故言善誤。九十歲,腎氣焦,四藏經(jīng)脈空虛?！睆?qiáng)調(diào)人體衰老始于肝,根于脾腎,機(jī)體衰老與臟腑功能減退密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為腎藏先天之精,是生命之本源,為人體先天之本。脾主運(yùn)化水谷精微,化生氣血,為人體后天之本。肝藏血,主疏泄,精血皆由水谷精微所化生和充養(yǎng),肝腎同源而藏泄互用。老年陽(yáng)虛者表現(xiàn)為機(jī)體陽(yáng)氣不足,虛寒內(nèi)生,溫煦推動(dòng)功能減退,其主要原因可歸納為腎氣虧虛,脾胃虛弱,肝陽(yáng)虛衰,肝失疏泄,氣血運(yùn)行不暢。本實(shí)驗(yàn)選用具有固護(hù)先天的關(guān)元、固護(hù)后天的足三里和益氣安神的百會(huì),是基于“雙固一通”針?lè)╗15]而來(lái),針灸“治未病”以正氣為本,固護(hù)先天和后天是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵,這為“雙固一通”電針?lè)ǚ乐侮?yáng)虛衰老提供了理論指導(dǎo)。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴,具有健脾益胃、補(bǔ)益氣血、強(qiáng)壯機(jī)體的作用;關(guān)元位于任脈,具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、延年益壽之效;百會(huì)歸屬督脈,與手足少陽(yáng)、足太陽(yáng)、足厥陰經(jīng)相交會(huì),故又稱三陽(yáng)五會(huì),其穴居巔頂,內(nèi)絡(luò)于腦,補(bǔ)之能益氣升陽(yáng),寧心安神。以往研究多從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫抗衰老、抗自由基氧化等方面研究關(guān)元、足三里、百會(huì)穴對(duì)老年機(jī)體延緩衰老的作用機(jī)制[16-17],而從肝能量代謝方面對(duì)老年陽(yáng)虛證的探討較少。

為了探討“雙固一通”配穴電針治療對(duì)老年陽(yáng)虛證肝臟能量代謝作用是否具有優(yōu)勢(shì),實(shí)驗(yàn)同時(shí)選取關(guān)元、足三里、百會(huì)各穴鄰近穴位(中極、陰陵泉、印堂)作為對(duì)照電針治療,結(jié)果表明,“雙固一通”電針對(duì)老年陽(yáng)虛模型大鼠陽(yáng)虛改善、肝線粒體超微結(jié)構(gòu)改善及ATP酶活性的提高能力均優(yōu)于中極、陰陵泉、印堂的治療效果。

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Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Hepatic Mitochondrial Structure and ATPase Activity in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

LIU Jian-min1, LV Jing-fang2, WANG Hua1, LIU Jing3, CHEN Ming-yang4, WANG Jing-zhi1. 1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China; 2.Shiyan Maternal and Child Health Hospital,Shiyan 442000,China; 3.Xiaogan Central Hospital,Xiaogan 432000,China; 4.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430010,China

ObjectiveTo explore the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on hepatic mitochondrial structure and ATPase activity in a rat model of senile yang deficiency.MethodsForty 5-month-old male SD rats were selected and randomly allocated to groups A, B, C and D, 10 rats each. Group A was a normal control group. A model of senile yang deficiency was made by 40 days’ subdermal injection of D-galactose and then 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone in the other three groups of rats. Group C received treatment with “double reinforcing and one unblocking”electroacupuncture at points Guangyuan(CV4), Zusanli(ST36) and Baihui(GV20); group D, treatment with electroacupuncture at points Zhongji(CV3), Yinlingquan(SP9) and Yintang(GV29). Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. After treatment, the anti-fatigue ability was determined by swimming exhaustion time, hepatic mitochondrial structure was observed under a transmission electron microscope and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities were measured by colorimetry in every group of rats.ResultsThe mean swimming exhaustion time shortened significantly (all P＜0.01); hepatic mitochondrial inner and outer membranes were blurred, mitochondrial ridges deformed, ruptured or disappeared and mitochondria swelled; both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.01, P＜0.05) in groups B, C and D of rats compared with group A. Swimming exhaustion time lengthened significantly (P＜0.01), hepatic mitochondrial structure improved significantly and both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities increased significantly (P＜0.01, P＜0.05) in group C compared with group B. Rat mean swimming exhaustion time shortened (P＜0.05), hepatic rough endoplasmic reticula degranulated and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.05) in group D compared with group B. Conclusion “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture can improve anti-fatigue ability, ameliorate hepatic mitochondrial ultrastructure, increase hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities and promote hepatic energy metabolism in a rat model of senile yang deficiency.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Yang deficiency syndrome; Hepatic mitochondria; ATPase; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.01.0063

2014-09-01

1005-0957(2015)01-0063-04

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2008CDA051)

劉建民(1976 - ),男,副教授

王華(1955 - ),男,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:Hwang.TCM@china.com