李樹臣尚緒山李東陳民龍蔭生

PRP聯(lián)合鹽酸川芎嗪對(duì)BMSCs體外增殖及向成骨細(xì)胞分化的影響

李樹臣1尚緒山1李東1陳民1龍蔭生2

目的通過(guò)將不同比例的富血小板血漿（Platelet-richplasma,PRP）與鹽酸川芎嗪聯(lián)合用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrowmesenchymal stemcells,BMSCs），觀察不同比例對(duì)其體外增殖及其向成骨細(xì)胞分化的影響。方法選取我院住院并簽訂知情同意書的患者為研究對(duì)象，抽取已簽訂知情同意書的患者靜脈血50mL，分別二次離心法制備PRP，進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)分析。根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)是否加入藥物為分組依據(jù)，分成A、B、C、D四組，A組為對(duì)照組，培養(yǎng)液中不加入藥物，其余三組分別將體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、50%的PRP與80%鹽酸川芎嗪按照1∶1.5混合加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中，檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況，細(xì)胞達(dá)到80%融合，消化收集細(xì)胞；計(jì)數(shù)確定各組細(xì)胞培養(yǎng)情況，確定加入PRP和鹽酸川芎嗪組對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。對(duì)加入PRP和鹽酸川芎嗪組培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，確定其成骨分化特性。結(jié)果各組PRP+鹽酸川芎嗪促進(jìn)MSCs增殖優(yōu)于對(duì)照組。達(dá)到80%融合時(shí)間更短。隨著PRP濃度增加細(xì)胞增殖效率顯著增加。結(jié)論 PRP與鹽酸川芎嗪對(duì)BMSCs的體外增殖有促進(jìn)作用，與PRP體積分?jǐn)?shù)和作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；富血小板血漿；鹽酸川芎嗪；體外增殖；實(shí)驗(yàn)研究

PRP是通過(guò)離心全血后得到的血小板的濃縮物，含有大量生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，其中以血小板源性生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子對(duì)促進(jìn)骨生長(zhǎng)和骨修復(fù)最為重要[1]。研究發(fā)現(xiàn)PRP加速組織修復(fù)的能力取決于其高濃度的生長(zhǎng)因子[2]，而 PRP中生長(zhǎng)因子的濃度則與其中的血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。近年來(lái)有臨床研究表明PRP有助于骨組織的愈合和再生[3]。據(jù)報(bào)道，川芎嗪可以誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，最佳誘導(dǎo)劑量為1.25g/L[4]。據(jù)此提出一個(gè)假設(shè)PRP是否可以與川芎嗪聯(lián)合用于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，所以實(shí)施本實(shí)驗(yàn)。

體外實(shí)驗(yàn)需時(shí)短、實(shí)驗(yàn)條件和因素易于控制，便于進(jìn)行復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具有避免體內(nèi)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)問(wèn)題優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮著極為重要的作用[5]。研究證明BMSCs經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，細(xì)胞增殖能力降低，但不會(huì)引起惡性變[6]。本研究作為課題的前期工作，通過(guò)制備PRP，以不同濃度聯(lián)合中藥川芎嗪對(duì)人BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同濃度對(duì)體外增殖及其向成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

在我院住院患者，經(jīng)知情同意者。

1.2 藥物及試劑

L-DMEM［低糖細(xì)胞培養(yǎng)基（批號(hào)16000044，美國(guó)）］，優(yōu)等胎牛血清（批號(hào) SV30087.02 Hyclone,南美），Percoll［硅膠顆?；鞈曳謱右海?.073×10-3g·L-1,Sigma,美國(guó)）］，PBS（無(wú)菌磷酸鹽緩沖液）（批號(hào)：20012-027，Gibco,美國(guó)），CD（單克隆抗體）13-PE（藻紅蛋白）、CD29-FITC（異硫氰酸）、CD34-FITC及 CD45-PE（BD醫(yī)療器械有限公司，美國(guó)），川芎嗪粉針劑（每支5mg，上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，批號(hào)11032912；日期2011年3月29日～2013年）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PRP制備方法[7]

抽取已簽訂知情同意書的患者靜脈血50mL，使用二次離心法制備PRP，然后進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)分析。

1.3.2 分組及給藥

該實(shí)驗(yàn)共分四組（由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象數(shù)量有限，沒有設(shè)立PRP組和單用鹽酸川芎嗪組）。A:對(duì)照組，培養(yǎng)液內(nèi)不加入藥物進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組分為B、C、D三組，分別將體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、50%的PRP與1.25g/L鹽酸川芎嗪（鹽酸川芎嗪的濃度按照所查文獻(xiàn)確定）按照1∶1.5混合加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中，（B:15% PRP+1.25g/L鹽酸川芎嗪；C:30%PRP+1.25g/L鹽酸川芎嗪；D:50%PRP+1.25g/L鹽酸川芎嗪）。

1.3.3 BMSCs培養(yǎng)

取4份3mL骨髓加入等量L-DMEM稀釋混勻后，1000r/ min，棄上清液，加入等量 L-DMEM稀釋混勻后1000r· min-1×15min，棄上清液，沉淀加入含10%胎牛血清的L-DMEM混勻，接種至1個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2，95%濕度的 CO2孵箱培養(yǎng)；72小時(shí)后更換培養(yǎng)基，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2～3天換一次；待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA（依地酸鈉鈣）消化，棄去胰酶，加入適當(dāng)培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打，用吸管吸取細(xì)胞懸液至離心管，1000r·min-1×5min，棄上清液；加入2mLL-DMEM重懸細(xì)胞沉淀并吹打成單細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)，按6000～8000·cm-2進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，標(biāo)記為P1代，培養(yǎng)過(guò)程中每2～3天換液一次，直至貼壁細(xì)胞約80%融合，再次傳代為P2代。

取P2代制成的單細(xì)胞懸液，按1.5×10000·cm-2接種至六孔板；待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每孔加2.5mL誘導(dǎo)液。（本課題提供PRP+1.25g/L鹽酸川芎嗪），對(duì)照組仍用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)；每隔3天換一次，第21天終止誘導(dǎo)；吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次；95%乙醇固定30min。蒸餾水沖洗3次；茜素紅染液37℃染色30min；蒸餾水沖洗3次，顯微鏡下攝像。

1.3.4 成骨誘導(dǎo)分化鑒定[8]

以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（100nmol·L-1地塞米松、50 mol· L-1左旋VitC、10nmol·L-1-磷酸甘油、50nmol·L-1FK506（他克莫斯））對(duì)P2代細(xì)胞培養(yǎng)。第7、14天時(shí)行堿性磷酸酶鈣鈷法染色、鈣茜素紅染色和Ⅰ、II型膠原免疫組化。

一是社會(huì)突發(fā)事件。社會(huì)突發(fā)事件往往最容易形成網(wǎng)絡(luò)輿情，在信息化時(shí)代，任何社會(huì)突發(fā)事件有可能引起網(wǎng)友激烈的討論。由于網(wǎng)絡(luò)社群的觀點(diǎn)不一，極易發(fā)生言論沖突，如果不及時(shí)處理，會(huì)引發(fā)群眾過(guò)激反應(yīng)，給社會(huì)穩(wěn)定帶來(lái)威脅。

2 結(jié)果

2.1 堿性磷酸酶鈣鈷法（14天結(jié)果）

誘導(dǎo)組細(xì)胞于第7天左右可見細(xì)胞表面，培養(yǎng)液內(nèi)有較多棕褐色細(xì)小顆粒出現(xiàn)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)棕褐色顆粒明顯增加，第14天時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)更明顯（圖1A），對(duì)照組兩個(gè)時(shí)間段陽(yáng)性程度明顯較弱（圖1B）（圖1彩圖見插頁(yè)）。

圖1 倒置相差顯微鏡（×10）

2.2 鈣茜素紅染色（14天結(jié)果）

誘導(dǎo)組細(xì)胞于第7天即可見陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞表面出現(xiàn)較多紅色著色。第14天時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)更明顯（圖2A），對(duì)照組兩個(gè)時(shí)間段陽(yáng)性程度明顯較弱（圖2B）（圖2彩圖見插頁(yè)）。

圖2 倒置相差顯微鏡（×10）

2.3 Ⅰ型膠原免疫組化

誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)至第14天，細(xì)胞外基質(zhì)可見大量條帶狀棕褐色著色。第14天時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)更明顯（圖3A），對(duì)照組基本無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)（圖3B）（圖3彩圖見插頁(yè)）。

圖3 Alcian Blue染色倒置相差顯微鏡（×10）

2.4 II型免疫組化反應(yīng)（14天結(jié)果）

圖4 Alcian Blue染色倒置相差顯微鏡（×10）

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（照片）

接種后第一天貼壁形態(tài)，圖5。經(jīng)三個(gè)不同比例 PRP+ 1.25g/L鹽酸川芎嗪培養(yǎng)10天，A只達(dá)到70%融合。B、C、D組已達(dá)到90%融合（圖6）（圖5、圖6彩圖見插頁(yè)）。

圖5 熒光素照片倒置相差顯微鏡（×10）

圖6 熒光素照片倒置相差顯微鏡（×10）

B，C組無(wú)明顯誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量差異免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組稍強(qiáng)，D組可見細(xì)胞融合好，數(shù)目相對(duì)較多，免疫組化顯示陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組更明顯。說(shuō)明 50%PRP+ 1.25g/L鹽酸川芎嗪組配比較佳。

2.6 細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BMSCs均一地表達(dá)CD13、CD29，HLA-DR（人類白細(xì)胞抗原），陽(yáng)性率分別為99.97%、98.46%和94.27%；而CD34、CD45和HLA-DR陰性，陽(yáng)性率分別為5.16%、1.34%和3.13%。

3 討論

BMSCs具有成骨分化能力，能夠促進(jìn)骨組織修復(fù)[9]。但是由于數(shù)量有限且較少，修復(fù)大的骨缺損需要較長(zhǎng)時(shí)間。然而緩慢的修復(fù)過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致修復(fù)的失敗和加重人體的不可逆性損害。加快修復(fù)的首要條件是要有足夠的BMSCs。因此BMSCs的體外培養(yǎng)增殖是不可或缺的。為了短時(shí)間內(nèi)在體外培養(yǎng)出足夠的BMSCs，研究者一直在不斷地尋找快速、高質(zhì)量的BMSCs培養(yǎng)基。

由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)分化率遠(yuǎn)較體外實(shí)驗(yàn)低，不同濃度的細(xì)胞因子有不同的誘導(dǎo)分化率[10]，中藥及其提純物為誘導(dǎo)分化提供了新思路。1999年研究者報(bào)道[11]，血漿富含生長(zhǎng)因子，利用其培養(yǎng)BMSCs，可以加強(qiáng)和加速骨再生，更迅速的軟骨組織愈合。而PRP中生長(zhǎng)因子的濃度則與其中的血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系[12]。

Ferreira等[13]在研究富血小板血漿對(duì)人成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用50%PRP來(lái)培養(yǎng)時(shí)結(jié)果成骨細(xì)胞生長(zhǎng)較快，但是在更深入的研究中發(fā)現(xiàn)12.5%和6.125%PRP成骨細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著PRP體積分?jǐn)?shù)和作用時(shí)間的增加，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖越快。本研究與前者區(qū)別就是加入了中藥川芎嗪。

川芎嗪是從中藥川芎中提取的一種生物堿單體，是一種新型的鈣離子拮抗劑，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，具有促進(jìn)骨髓移植后造血重建等作用[14]。川芎嗪可體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后神經(jīng)元樣細(xì)胞初步觀察可活5天。研究表明川芎嗪能使BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)、外Ca2+的減少可促進(jìn)川芎嗪誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化[15,16]。

本研究表明PRP聯(lián)合鹽酸川芎嗪對(duì)BMSCs的體外增殖有促進(jìn)作用，與PRP體積分?jǐn)?shù)和作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。但本研究有不足之處：由于川芎嗪為中藥，藥物輔料的存在可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響；實(shí)驗(yàn)分組是未設(shè)立PRP組和單用鹽酸川芎嗪組，可能會(huì)忽略其中一種藥物的某種作用。對(duì)于二者共同應(yīng)用BMSCs基中時(shí)二者之間是否發(fā)生反應(yīng)，對(duì)于中藥聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)制尚不明確，尚需進(jìn)一步深入研究。中藥誘導(dǎo)BMSCs定向分化是近年來(lái)一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，中藥有著源廣、價(jià)廉、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)干細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)分化無(wú)毒且有利于分化后細(xì)胞活體移植。所以，采用聯(lián)合中藥培養(yǎng)BMSCs具有美好的前景。

[1] Zhang Li,Peng Li-pan,Wu Nan,et al.Development of bone marrow mesenchymal stem cell culture in vitro[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版），2012，125（9）:1650-1655.

[2]蘇曉慧，孔祥英，吳文彬，等.風(fēng)濕清對(duì)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（4）:173-176.

[3]楊麗，趙新蘭，雷丹丹，等.miR-125a/TRAF6調(diào)控通路在破骨細(xì)胞分化中的作用研究[J].疑難病雜志，2014（11）:1160-1164.

[4] 陳兵，尹延慶，柯俊龍，等.川芎嗪誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞:最佳誘導(dǎo)劑量篩選[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010.

[5] 張?jiān)?，郭永榮，劉霞等.人破骨細(xì)胞分化中重組結(jié)核桿菌熱休克蛋白10的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2014（38）:6116-6122.

[6] 何飛，吳勇，周艷，等.Notch信號(hào)促進(jìn)核因子 B受體活化因子配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的體外研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015（1）:25-28.

[7] 董偉，馮曉潔，梁永強(qiáng)，等.雙膦酸鹽對(duì)破骨細(xì)胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2014（38）:6069-6073.

[8] 王汝杰，鄧小軍，劉復(fù)州，等.Jagged1活化Notch通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并抑制其增殖[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31（10）: 2262-2264.

[8] 甄茹，俸婷婷，趙致，等.黑骨藤抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收能力的活性部位研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（1）:112-116.

[9] 張杭，孫天威.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞研究進(jìn)展[J].國(guó)際骨科學(xué)雜志，2011，32（2）:104-106.

[11]Li Jinghui,Liu Dayong,Zhang Fangming,et al.Human dental pulp stem cell is a promising autologous seed cell for bone tissue engineering[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版）,2011,124(23):4022-4028.

[12]Du William,Fang Ling,Yang Weining,et al.The role of versican G3 domain in regulating breast cancer cell motility including effects on osteoblast cell growth and differentiation in vitro-evaluation towards understanding breast cancer cell bone metastasis[J]. BMC Cancer,2013,12（1）.

[13]Zhang Xiao,Lin Liang-bo,Xu Dao-jing,et al.Wntaenhances bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版），2013，126（24）: 4758-4763.

[14]Liu Bowu,Lv Anlin,Hou Jing,et al.Cardiac differentiation and electrophysiology characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版），2012，125（18）:3318-3324.

[15]劉云云，趙興緒，趙紅斌，等.Ca2+信號(hào)介導(dǎo)川芎嗪誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（2）:1-5.

[16]康健，侯洋，周許輝，等.全骨髓貼壁法獲取組織工程髓核種子細(xì)胞的相關(guān)研究[J].生物骨科材料與臨床研究，2014，11（1）: 10-15.

Impacts of PRPand ligustrazine hydrochloride on BMSCs in vitro prolif-eration and definitive differentiation to osteoblast

Objective To applythe combinedadministrationof platelet-richplasma（PRP）and 1i-gustrazinehydrochloride on human bone marrow mesenchymal stem cell（BMSCs）at different ratios and observe the impacts on the in vitro proliferation and definitive differentiation to osteoblast.Methods Select hospital and signed informed consent in our hospital patients as the research object,the extraction have been signed informed consent of vein blood of patients with 50mL, two PRP were prepared by centrifugal casting,the platelet count analysis.According to the bone marrow mesenchymal stem cells cultured on whether or not to join the drug is the grouping basis,divided into A,B,C,D four groups,group A was the control group,the drug does not join in culture liquid,the other three groups respectively,the volume fraction of15%,30%,50%PRP and 80%of ligustrazine hydrochloride inaccordancewith 1:1.5mix bonemarrowmesenchymal stem cells were cultured in the media,the detection of cell proliferation,cell reached 80%confluence,digestive cells were collected;count was determined incell culture conditions,todetermine the influenceofjoiningPRP and ligustrazine hydrochloride group on cell culture.To join the PRP and ligustrazine hydrochloride group cultured cells of osteogenic induction,determinetheosteogenicdifferentiation.Results PRP+ligustrazinehydrochloride promotedBMSCs proliferation in each group,which was superior to the control group and 80%of infusion was obtained in very short time.With the increase of PRP concentration,the efficiency of cell proliferation was enhanced significantly.Conclusion PRP and ligustrazine hydrochloride promote the in vitro proliferation of human BMSCs,which presents the positive correlation with PRP volume fraction and effect time.

Bonemarrowmesenchymalstemcells（BMSCs）;Platelet-richplasma（PRP）;Ligustrazine Hydrochloride; In Vitro Proliferation

R318.5

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.05.001

swgk2015-01-00014

李樹臣（1967-）男，本科，副主任醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)內(nèi)科、血液。

2015-01-26）

1山東省新泰市第二人民醫(yī)院，山東新泰271219；2河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南洛陽(yáng)471013