胡墨　楊玉飛　劉小云

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析化學(xué)研究所和合成與功能生物分子中心　北京 100871)

病原微生物感染的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

胡墨楊玉飛劉小云*通訊聯(lián)系人，E-mail:xiaoyun.liu@pku.edu.cn

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析化學(xué)研究所和合成與功能生物分子中心北京 100871)

摘要基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)在近20年有巨大的發(fā)展。在其應(yīng)用中，病原微生物和與感染相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)具有重要科學(xué)意義，體系復(fù)雜度又相對較小，一直受到廣泛關(guān)注并有較快發(fā)展。本文從感染中病原微生物和宿主的蛋白質(zhì)組學(xué)兩方面入手，簡要綜述應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究感染過程的相關(guān)工作，著重介紹該領(lǐng)域近幾年的主要進(jìn)展，并對其發(fā)展做出展望。

關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜病原微生物宿主感染

A Proteomic View of Host-pathogen Interactions

and Infection Biology

Hu MoYang YufeiLiu Xiaoyun*

(CollegeofChemistryandMolecularEngineering,InstituteofAnalyticalChemistryandSyntheticandFunctional

BiomoleculesCenter,PekingUniversity,Beijing100871,China)

AbstractMS-based proteomics has undergone rapid advancements in recent years. As infectious diseases cause millions of death each year, it has become increasingly important to study host-pathogen interactions on the molecular level. Recently, proteomic analyses of pathogens and their mammalian host have received widespread attentions. Here we review the major progress made in this area within the last decade.

Key WordsProteomics; Mass spectrometry; Pathogen; Host; Infection

1背景介紹

蛋白質(zhì)組學(xué)最早的工作來自于對細(xì)菌蛋白組的研究[1]。1975年，Patrick O′Farrell使用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)對大腸桿菌(Escherichiacoli)蛋白進(jìn)行分離，得到超過1000個(gè)凝膠點(diǎn)，標(biāo)志著人類第一次實(shí)現(xiàn)了對生物體全部蛋白進(jìn)行系統(tǒng)層次的分離[2]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，蛋白質(zhì)組(proteome)這一概念最早于1996年被提出[3]，指一個(gè)細(xì)胞或生物體內(nèi)全部的蛋白質(zhì)；分析蛋白質(zhì)組的學(xué)科則被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)[4]。蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，一切基因和轉(zhuǎn)錄層次的變化，最終都要在蛋白質(zhì)的層次(如表達(dá)量和翻譯后修飾)發(fā)生變化才能表現(xiàn)出其生命意義。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)一直受到生命科學(xué)研究者的廣泛關(guān)注。

在基質(zhì)輔助激光解吸(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)和電噴霧(electrospray ionization,ESI)這兩種可電離多肽和蛋白質(zhì)的離子化技術(shù)產(chǎn)生后，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)(mass spectrometry-based proteomics)得到了快速發(fā)展[5-6]。多肽和蛋白質(zhì)離子在一定的激發(fā)條件如碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation，CID)或電子俘獲解離(electron capture dissociation，ECD)等作用下，產(chǎn)生在肽鏈骨架上的斷裂，即可通過多肽/蛋白質(zhì)的多級質(zhì)譜得到其結(jié)構(gòu)信息。與傳統(tǒng)分析化學(xué)和生物化學(xué)鑒定蛋白采用的氮端測序和免疫印跡等方法相比，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)擁有分析速度快、樣品用量小、序列覆蓋率高、定量手段成熟、易于分析翻譯后修飾等眾多優(yōu)點(diǎn)。因此，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域最主要也是發(fā)展最快的方法。

與高等真核生物的蛋白組相比，原核生物編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量少得多，蛋白的復(fù)雜性(如RNA剪切造成的一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)蛋白)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于高等真核生物。從分析化學(xué)的角度來說，體系的復(fù)雜度相對較小，因此以原核生物及其他微生物作為模型體系的蛋白質(zhì)組學(xué)相對發(fā)展較快。在研究微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)，一個(gè)具有重要科學(xué)意義的問題是病原微生物和與感染(infection)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，病原微生物引發(fā)的傳染病造成的死亡占2011年全部死亡原因的1/3，因此對病原微生物感染過程的研究也具有極其重要和迫切的現(xiàn)實(shí)意義。在病原微生物入侵和感染宿主以及宿主拮抗病原微生物感染的過程中，執(zhí)行關(guān)鍵生命活動的蛋白質(zhì)究竟有哪些？它們是如何發(fā)揮生命作用的？這些問題都只有在蛋白質(zhì)層次進(jìn)行研究才能得到最終的解答。通過對這些重要生命過程分子機(jī)制的理解，人們將對病原微生物-宿主相互作用的過程有更加深入的認(rèn)識，從而為設(shè)計(jì)抗感染的藥物以及抑制病原微生物引發(fā)的傳染病提供思路。

學(xué)術(shù)期刊Proteomics在2011年已出版了關(guān)于微生物蛋白質(zhì)組學(xué)的?？痆7]，其中大部分工作與病原微生物有關(guān)。本文將從病原微生物和宿主兩方面入手，簡要介紹應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究病原微生物感染過程的相關(guān)工作，著重介紹該領(lǐng)域最近幾年的主要進(jìn)展，并對相關(guān)方面的發(fā)展做出展望。

2病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)

2.1　體外培養(yǎng)條件下病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)

在病原微生物-宿主相互作用體系中，病原微生物的蛋白組相對簡單，因此病原微生物成為應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究這個(gè)體系時(shí)的首要目標(biāo)。體外培養(yǎng)條件下獲取大量病原微生物相對簡單，早期相關(guān)研究主要集中在體外培養(yǎng)環(huán)境下的病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)。

Adkins等比較了野生型沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium，LT2)和一種毒性更強(qiáng)的沙門氏菌亞型(14028)在對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和缺鎂的基本培養(yǎng)基中的蛋白組[8]，共鑒定到2343個(gè)蛋白。通過在系統(tǒng)層次比較兩種不同基因型的沙門氏菌的蛋白表達(dá)組，他們發(fā)現(xiàn)一些受pdu啟動子調(diào)控的蛋白在14028亞型中具有更高的表達(dá)量。他們的工作表明，pdu啟動子對于沙門氏菌的致病性有著重要的意義。

Ansong等比較了野生型、敲除hfq或smpB基因的沙門氏菌在4種體外培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的差異[9]。hfq和smpB兩個(gè)突變株中20%和4%的蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化，生物信息學(xué)分析表明受調(diào)控的蛋白包括與入侵相關(guān)、細(xì)胞基礎(chǔ)代謝、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)合成、脂肪酸合成等功能。

Becher等以穩(wěn)定同位素(氮-15)代謝標(biāo)記定量的方法鑒定了處于對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白表達(dá)組[10]。為了提高蛋白鑒定的覆蓋率，他們通過亞細(xì)胞分離的方法把金黃色葡萄球菌在體外條件下分成4個(gè)組分：胞漿蛋白、膜蛋白、細(xì)胞表面蛋白和胞外蛋白。最終他們鑒定到1703個(gè)蛋白(定量1450個(gè)蛋白)，達(dá)到了對全蛋白組65%的蛋白覆蓋率。

總結(jié)已有的工作，一些重要的病原微生物如沙門氏菌[8-9，11-13]、志賀氏菌[14-16](Shigellaflexneri)、綠膿桿菌[17-19](Pseudomonasaeruginosa)、幽門螺桿菌[20-25](Helicobacterpylori)、結(jié)核分枝桿菌[26-27](Mycobacteriumtuberculosis)、金黃色葡萄球菌[10]、炭疽芽孢桿菌[28](Bacillusanthracis)在體外培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)都已有相關(guān)報(bào)道。與植物病原真菌相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)工作也已有詳盡綜述發(fā)表[29]，本文不再贅述。

感染宿主前后，病原微生物的生存環(huán)境有顯著的變化，因此病原微生物的應(yīng)激反應(yīng)是研究的一大重點(diǎn)。在體外培養(yǎng)中，病原微生物的代謝模式、生長速率控制以及刺激效應(yīng)蛋白分泌(即模擬入侵宿主時(shí)的條件)下的蛋白調(diào)控一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。常見的控制條件為不同培養(yǎng)條件(無氧、高鹽、不同碳源、培養(yǎng)基中某些離子缺陷、溫度)、不同生長階段(對數(shù)期和平臺期)等。其中通過模擬感染后體內(nèi)環(huán)境的體外培養(yǎng)條件研究感染時(shí)病原微生物發(fā)生的重要變化(如代謝調(diào)整(碳源和某些離子的代謝)、群體感應(yīng)系統(tǒng)[30](quorum sensing)等)通常是進(jìn)一步生物研究的主要方向。通常的研究思路是通過蛋白質(zhì)組學(xué)大規(guī)模表征病原微生物在不同培養(yǎng)條件下(或敲除某些關(guān)鍵基因后)的蛋白表達(dá)組變化，從而得出病原微生物的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)理或其中關(guān)鍵蛋白的作用通路及信號網(wǎng)絡(luò)。也有一些工作研究了病原微生物中某些修飾組的變化，詳見Jones[31]和Macek[32]的綜述。

2.2　感染過程中體內(nèi)病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)

與大量宿主細(xì)胞相比，病原微生物的蛋白量通常遠(yuǎn)小于宿主；同時(shí)，入侵宿主的病原微生物的量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于體外培養(yǎng)。因此，在體內(nèi)蛋白組的實(shí)驗(yàn)中，為了達(dá)到更高的選擇性和靈敏度，首先要解決的問題是從宿主細(xì)胞中分離出體內(nèi)病原微生物。目前主要有3種分離方法[33]，即離心(centrifugation)、基于免疫磁珠分離(immunomagnetic separation,IMS)及流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)。

感染過程中體內(nèi)微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)始于2006年Becker等的工作[34]。他們采用流式細(xì)胞術(shù)從受到沙門氏菌感染的小鼠體內(nèi)分離出沙門氏菌。在他們的分離條件下，對沙門氏菌蛋白的鑒定受到宿主蛋白的極大干擾，在鑒定到的蛋白中，超過70%都是宿主的蛋白。但液質(zhì)聯(lián)用平臺極強(qiáng)的分離鑒定能力仍使他們共鑒定到約700個(gè)沙門氏菌的蛋白。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明，沙門氏菌的代謝中廣泛存在著代謝冗余機(jī)制(metabolic redundancy)，只有極少數(shù)酶是其代謝所必需的。因此抗感染的藥物所能針對的目標(biāo)代謝途徑很有限。

關(guān)于體內(nèi)病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)早期的發(fā)展，Schmidt等已在2011年進(jìn)行了綜述[33]。當(dāng)前這一領(lǐng)域最大的不足之處是與體外培養(yǎng)相比，鑒定到的蛋白數(shù)量還相對較少，通常只有幾百個(gè)蛋白，覆蓋率僅10%～20%(圖1)[35～37]。這對于從蛋白組數(shù)據(jù)中分析病原微生物入侵后采用的分子機(jī)制，發(fā)掘具有重要生物學(xué)意義的結(jié)果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

圖1　幾種病原微生物在體外培養(yǎng)和宿主細(xì)胞內(nèi)鑒定到的蛋白數(shù)量與基因組理論編碼蛋白數(shù)量的比較參考文獻(xiàn)：沙門氏菌[8,34-35]；志賀氏菌[14,38]；結(jié)核分枝桿菌[26,36]；金黃色葡萄球菌[10,37]；牙齦卟啉單胞菌[39]；空腸彎曲菌[40]

隨著胞內(nèi)病原微生物分離過程的優(yōu)化及更高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用平臺的應(yīng)用，從數(shù)量極其有限的胞內(nèi)微生物中進(jìn)行高覆蓋率蛋白組分析逐漸成為可能[38-40]。空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是一種重要的造成食源性疾病的細(xì)菌。Liu等通過定量蛋白組分析感染COS-1細(xì)胞的空腸彎曲菌蛋白組。他們采用離心方法分離胞內(nèi)細(xì)菌，取得了較好的分離效果(宿主細(xì)胞干擾小于15%)[40]，鑒定到1428個(gè)蛋白，覆蓋率達(dá)到86%。通過高覆蓋率的體內(nèi)蛋白組數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌入侵宿主細(xì)胞后，代謝水平發(fā)生了顯著下降，并且重新調(diào)整了呼吸模式，更傾向于采用富馬酸作為電子給體。他們的結(jié)果有助于人們針對胞內(nèi)病原微生物特殊的代謝途徑發(fā)展應(yīng)對策略。

Pieper等采用類似方法研究了另一種重要病原微生物——志賀氏菌在宿主細(xì)胞體內(nèi)的蛋白組變化[38]。他們采用超速離心的方法分離體內(nèi)細(xì)菌，對比了體外培養(yǎng)，胞內(nèi)和與細(xì)胞共同培養(yǎng)但不具備入侵能力的志賀氏菌的蛋白組。定量蛋白組數(shù)據(jù)表明志賀氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)所用的主要碳源發(fā)生了明顯變化，并且與攝取鐵離子相關(guān)的蛋白發(fā)生了明顯上調(diào)，相關(guān)蛋白突變體的進(jìn)一步驗(yàn)證表明感染后志賀氏菌在宿主體內(nèi)的增殖依賴于其獲取鐵離子的量。

絕大多數(shù)對于病原微生物的研究都以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)獲得在感染過程中的相關(guān)機(jī)制作為最終的目標(biāo)，關(guān)于病原微生物的蛋白組研究同樣如此。相信隨著體內(nèi)病原微生物分離和蛋白質(zhì)組學(xué)液質(zhì)聯(lián)用平臺的進(jìn)一步發(fā)展，將實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)鑒定到與體外培養(yǎng)條件下數(shù)量相近的蛋白。從而通過更具深度和廣度的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，給出病原微生物感染宿主后啟動的重要分子機(jī)制，并為特異性抑制感染提供新思路。

3感染過程中宿主的蛋白質(zhì)組學(xué)

與病原微生物相對簡單的蛋白組相比，宿主通常是高等真核生物，其基因數(shù)量和翻譯出的蛋白組的復(fù)雜度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。對宿主細(xì)胞進(jìn)行高通量高覆蓋率的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析在技術(shù)上是更大的挑戰(zhàn)。

對宿主蛋白表達(dá)組的研究可按照分析的宿主蛋白目標(biāo)不同，分為蛋白表達(dá)組(包括全蛋白組、亞細(xì)胞蛋白組)和修飾組兩類。亦可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的不同分為兩類：以病原微生物的某些模型代謝產(chǎn)物(如革蘭氏陰性菌的脂多糖)或病原菌組成部分(如鞭毛)刺激；以病原微生物(野生型或基因缺陷型)感染。

3.1　表達(dá)組

Dhungana等應(yīng)用脂多糖刺激巨噬細(xì)胞，采用穩(wěn)定同位素氨基酸代謝標(biāo)記(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)進(jìn)行蛋白定量[41]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在脂多糖刺激后重新分布到脂筏區(qū)(lipid raft region)；MEK-ERK通路的激活也對蛋白酶體激活有調(diào)控作用。

Du等采用SILAC定量研究了LPS刺激僅10分鐘后的宿主細(xì)胞蛋白組[42]。通過亞細(xì)胞分離，有效分離出胞漿和細(xì)胞核兩個(gè)組分，從而提高了蛋白組鑒定的深度和廣度。胞漿和細(xì)胞核中各有611和758個(gè)蛋白在LPS刺激10分鐘后表達(dá)量發(fā)生顯著變化。通過通路分析，他們發(fā)現(xiàn)MAPK和NF-κB通路在刺激10分鐘后即發(fā)生了顯著變化，說明宿主細(xì)胞對于病原微生物的應(yīng)激反應(yīng)是十分迅速的。

中性粒細(xì)胞(neutrophil)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，而中性粒細(xì)胞網(wǎng)具有降解效應(yīng)蛋白、消滅革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌的作用。Urban等提取并分析了中性粒細(xì)胞網(wǎng)的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)了24個(gè)與中性粒細(xì)胞網(wǎng)相關(guān)的蛋白[43]。他們在其中發(fā)現(xiàn)了鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin)。進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，鈣衛(wèi)蛋白確實(shí)參與了中性粒細(xì)胞網(wǎng)的形成。

Hardwidge等分析了野生型和三型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system)缺失的突變型致病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)感染后Caco-2細(xì)胞系的蛋白組[44]。在鑒定到的2090個(gè)宿主蛋白中，264個(gè)的表達(dá)量有顯著差異。

Backert等則結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的手段分析野生型及缺失四型分泌系統(tǒng)的幽門螺旋桿菌感染后的人胃上皮細(xì)胞[45]。他們采用二維凝膠電泳分離，鑒定到190個(gè)發(fā)生顯著變化的蛋白。其中161個(gè)蛋白在感染后mRNA水平發(fā)生顯著變化。他們的工作驗(yàn)證了四型分泌系統(tǒng)在幽門螺旋桿菌感染過程中的重要作用。

Meissner等人分析了脂多糖刺激后小鼠巨噬細(xì)胞的分泌蛋白組[46]。他們的研究包括5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)和4種基因型的小鼠(WT/MyD88-ko/Trif-ko/MyD88-ko &Trif-ko)，并同時(shí)分析了分泌組和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化。在受到LPS刺激后，免疫細(xì)胞分泌蛋白組發(fā)生了極其顯著的變化，部分蛋白分泌量的變化超過了1000倍。而敲除兩個(gè)TLR4重要的接頭蛋白MyD88或Trif后，巨噬細(xì)胞對于刺激的響應(yīng)明顯減弱。除了證明兩個(gè)接頭蛋白對于TLR4的信號傳遞通路引起的下游分泌蛋白的變化具有重要作用外，作者還通過對比單雙敲除體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，兩個(gè)接頭蛋白對下游分泌蛋白的調(diào)控具有冗余作用、協(xié)同作用等幾種不同的方式。

3.2　修飾組

除了表達(dá)量不同，不同的翻譯后修飾也會極大地影響蛋白質(zhì)的功能[47]。Sharma等研究了脂多糖刺激不同時(shí)間后巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白組[48]。大約140個(gè)磷酸化位點(diǎn)(175個(gè)磷酸化肽)在LPS刺激后發(fā)生了顯著變化。大規(guī)模磷酸化蛋白組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于發(fā)現(xiàn)TLR4通路相關(guān)蛋白有著重要作用。另外，通過生物信息學(xué)分析結(jié)合時(shí)間分辨的磷酸化蛋白組數(shù)據(jù)，人們對于LPS刺激后的巨噬細(xì)胞的不同時(shí)間、空間上不同細(xì)胞器相關(guān)蛋白的響應(yīng)有了新的認(rèn)識。

Rogers等研究了沙門氏菌感染后宿主細(xì)胞磷酸化蛋白組的變化[49]。通過未感染/野生型感染/缺失效應(yīng)蛋白SopB的沙門氏菌的對照，他們從系統(tǒng)層面研究了效應(yīng)蛋白SopB對宿主磷酸化蛋白組的影響，實(shí)驗(yàn)表明感染后宿主細(xì)胞磷酸化水平的變化之中有大約一半與SopB有關(guān)，說明SopB對于宿主細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有著廣泛的調(diào)控。

在對感染過程中宿主細(xì)胞蛋白組的研究方面，以下幾個(gè)問題受到廣泛關(guān)注[50]：宿主細(xì)胞對病原微生物的感受機(jī)制及受體蛋白；病原微生物效應(yīng)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的作用目標(biāo)；病原微生物引起的宿主細(xì)胞信號傳遞鏈的變化；宿主細(xì)胞的免疫相關(guān)反應(yīng)(如抗體的產(chǎn)生、免疫相關(guān)信號通路和分泌蛋白的變化)等。

4總結(jié)和展望

隨著病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，早期圍繞著體外培養(yǎng)病原微生物和蛋白鑒定的工作已經(jīng)不再成為主流，而研究感染后體內(nèi)病原微生物和宿主細(xì)胞的工作在近幾年不斷增加。通過在系統(tǒng)層次高通量高覆蓋率分析感染后病原微生物和宿主蛋白組的變化，我們將更加深入地認(rèn)識在感染過程之中二者分別使用的主要分子機(jī)制。另外，結(jié)合多種蛋白質(zhì)組學(xué)手段(如修飾組、分泌組、蛋白相互作用組)及上下游組學(xué)手段(轉(zhuǎn)錄組、代謝組)并互相對照[9,28,46]，也會極大地推動人們對于病原微生物感染過程的認(rèn)識。最終，以后續(xù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證前期組學(xué)實(shí)驗(yàn)得到的初步結(jié)論及其功能，也將進(jìn)一步促成蛋白質(zhì)組學(xué)從產(chǎn)生組學(xué)數(shù)據(jù)向解答重要生命科學(xué)問題的重要轉(zhuǎn)變。

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中圖分類號O6；G64

doi:10.3866/pku.DXHX20150303