李明明，潘 文，康開彪

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省中醫(yī)藥研究院

不同造模方法對大鼠多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗模型的影響*

李明明1，潘 文2△，康開彪2

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省中醫(yī)藥研究院

目的:采用不同方法誘導(dǎo)SD清潔級雌性大鼠多囊卵巢綜合征(PCOS)伴胰島素抵抗（IR）動物模型，造模完成后檢測大鼠血清相關(guān)激素、空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS）并觀察卵巢局部形態(tài)學(xué)改變。方法:分別采用來曲唑、脫氫表雄酮、左旋-十八甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG誘導(dǎo)大鼠PCOS伴IR模型，ELISA法測定血清促黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、空腹胰島素(FINS)水平，并用血糖儀測定FPG，HE染色后光鏡下觀察卵巢局部形態(tài)。結(jié)果:A組(對照組)和B組(來曲唑組)比較，B組較A組血清FSH、FINS及T濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；B組血清LH濃度較A組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組(左旋-十八甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG組)與C組(對照組)比較，D組血清LH、E2濃度較C組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；D組T濃度較C組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。E組(脫氫表雄酮組)中途失敗剔除。A、C2組卵巢局部形態(tài)基本正常，可見發(fā)育成熟的卵泡及優(yōu)勢卵泡，B、D二組未見優(yōu)勢卵泡，均可見卵巢多囊樣改變。結(jié)論:使用來曲唑或左旋-十八甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG誘導(dǎo)大鼠PCOS伴IR模型，無論在影響血清激素及FPG、FINS，還是卵巢局部形態(tài)學(xué)改變方面與臨床表現(xiàn)很接近，符合動物PCOS伴IR造模要求。

造模方法；大鼠PCOS伴IR模型；激素水平；卵巢形態(tài)

多囊卵巢綜合征 (p o l ycyst i c o v ary sy n drome，P C O S)是婦科常見的生殖功能障礙性疾病，其發(fā)病率占育齡婦女的5%～10%，占排卵障礙性不孕患者的70%以上[1]。該病病因病理復(fù)雜，目前P C O S患者大多依靠藥物來治療，手術(shù)治療者相對較少，以致臨床取材困難，這對探索研究P C O S病理生理機制及治療效果帶來諸多困難。研究已證實，多數(shù)P C O S患者普遍存在I R，I R已被認為是P C O S患者最基本的病理生理改變，是導(dǎo)致P C O S卵巢無排卵和雄激素過多、產(chǎn)生遠期代謝并發(fā)癥的關(guān)鍵。因此，建立一種理想的P C O S伴I R動物病理模型以深入研究和探討P C O S伴I R的發(fā)生、發(fā)展及治療，是目前迫切需要解決的問題。因此，建立P C O S伴I R動物模型以及對動物模型進行實驗研究，對指導(dǎo)臨床的診斷和治療有深遠的意義。本研究在參考目前國內(nèi)常用的幾種造模方法的基礎(chǔ)上，分別采用來曲唑、脫氫表雄酮、左旋-十八甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合H C G誘導(dǎo)大鼠P C O S伴I R模型，然后采用酶聯(lián)免疫(E L S IA)法檢測血清促黃體生成素(L H)、促卵泡生成素(F S H)、雌二醇(E2)、睪酮(T)和空腹胰島素(F IN S)水平并利用S P SS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，旨在通過比較幾種不同造模方法在影響大鼠內(nèi)分泌激素上的差異，探討最佳P C O S伴I R動物造模方法，為今后研究中醫(yī)藥防治P C O S伴I R及其分析其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 來曲唑(大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：M B1137)。臨用時用1%羧甲基纖維素溶液配成所需濃度，羧甲基纖維素鈉(北京生物試劑公司生產(chǎn)，批號：S i gma C4888)，絨毛膜促性腺激素(廣東麗珠集團麗珠制藥廠生產(chǎn)，批號：20070622)。

1.1.2 動物 6周齡S D清潔級雌性大鼠20只(平均體質(zhì)量為180 g)，23日齡S D清潔級雌性大鼠30只(平均體質(zhì)量為120 g)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，批號：SC X K(甘)2000-0001-62001000000012。

1.1.3 試劑 L H、F S H、E2、T、F IN S測定試劑盒，均購自上海豐翔生物技術(shù)有限公司，批號為：20140425；血糖檢測使用A CC U-C HEK Act iv e血糖儀，購自德國R oc h e D i ag n ost i cs GmbH公司。

1.1.4 儀器 B S-124S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司提供)、EP C O H酶標(biāo)儀(基因有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 參照文獻［2］采用隨機數(shù)字表法，將6周齡大鼠隨機分為A組和B組；23日齡大鼠隨機分為C組、D組、E組，每組各10只。A、C組每只大鼠均飼以顆粒飼料并自由飲水，每日保證10小時光照時間；B、D、E組每只大鼠均飼以高脂高糖飼料并給予5%葡萄糖水，每日光照時間保證10小時。

1.2.2 給藥方法 B組每日灌胃服用來曲唑1mg/（k g·d）劑量，溶于1%C M C(羧甲基纖維素)中，連續(xù)定時灌服24日，每日用顯微鏡觀察陰道涂片，建立來曲唑誘導(dǎo)的大鼠P C O S模型；A組每日灌胃服用生理鹽水1mg/（k g·d）劑量，連續(xù)定時灌服24日。D組23日齡皮下埋植(5%利多卡因局麻后于大鼠股部內(nèi)側(cè)皮埋避孕棒)左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(3mm)，在27日齡時每日2次皮下(頸背部皮下)注射1.5 I U的H C G，共注射9天，至36日齡，C組不予處理。建立孕激素聯(lián)合H C G誘導(dǎo)的大鼠P C O S伴I R模型；E組皮下(頸背部皮下)注射DHEA 0.06mg/g+0.2m L注射油劑（DHEA溶于0.2m L甘油），連續(xù)20天。100 g體質(zhì)量大鼠應(yīng)配制注射液濃度為30mg/m L，將此作為DHEA注射液的標(biāo)準(zhǔn)濃度，注射量按0.002m L/g體質(zhì)量來計算。建立DHEA誘導(dǎo)的大鼠P C O S伴I R模型。停藥后，連續(xù)陰道涂片7天，觀察陰道上皮周期性變化初步判斷造模是否成功。

1.2.3 觀測指標(biāo) 在最后1次用藥24小時后，于造模最后一天晚8：00開始禁食，次日上午8：00血糖儀測定空腹血糖(F PG)水平，操作按說明書要求進行。后于腹腔注入0.24mo l/L水合氯醛(400mg/k g)麻醉后取腹主動脈血，取血后用9%生理鹽水沖洗卵巢至滲液清亮，摘取雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下去除卵巢表面的脂肪組織，觀察卵巢大體解剖情況并分別測量雙側(cè)卵巢的長、寬、高，稱雙側(cè)卵巢質(zhì)量，用40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。血液標(biāo)本經(jīng)3 000 r/m in離心10分鐘后，收集血清，-20℃保存，酶聯(lián)免疫法測定血清L H、F S H、E2、T、F IN S水平。計算胰島素抵抗指數(shù)(H OM A-I R)=F PG×F IN S/22.5。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用S P SS15.0軟件進行處理，以(±s)表示。2組組間比較，符合正態(tài)性和方差齊性者，采用成組t檢驗，不符合正態(tài)性和方差齊性者，進行秩和檢驗；以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 采用來曲唑造模對大鼠血清相關(guān)激素的影響 B組血清T、F S H、F IN S濃度升高較A組顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；B組血清L H濃度較A組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 采用左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG組對大鼠血清相關(guān)激素的影響 D組較C組血清L H、E2、F IN S濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；D組血清T濃度較C組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。2組間血清性激素及F S H比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 大鼠血糖、FINS及HOMA-IR B組F PG、F IN S及H OM A-I R均分別顯著高于A組(P＜0.05)；D組F PG、F IN S高于C組(P＜0.05)，H OM A-I R各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表1 采用來曲唑造模對大鼠血清相關(guān)激素的影響

表2 采用左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG造模對大鼠血清相關(guān)激素的影響

表3 各組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的比較

2.4 各種造模方法對卵巢局部形態(tài)學(xué)的影響 采用石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察各組卵巢局部形態(tài)?？梢夾、C兩個對照組大鼠局部形態(tài)正常，有發(fā)育成熟的卵泡，顆粒細胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列，泡膜細胞及間質(zhì)細胞無明顯增生現(xiàn)象；B、D兩個造模組見卵泡囊性擴張，少量的生長卵泡黃體、顆粒細胞層數(shù)減少，僅為2～3層，排列疏松，泡膜細胞層增生。見圖1—2。

圖1 對照組光鏡結(jié)果

圖2 模型組光鏡結(jié)果

3 討論

3.1 關(guān)于PCOS伴IR大鼠模型建立的理論依據(jù)

3.1.1 采用來曲唑造模的理論依據(jù) P C O S的典型特征是持續(xù)不排卵和雄激素增高，卵巢局部高雄激素是導(dǎo)致P C O S的主要原因。芳香化酶是雌激素形成的最后一步限速酶，它廣泛存在于人體的各個組織中，如卵巢、胎盤、睪丸、外周脂肪組織等，卵巢內(nèi)此酶的活性下降可導(dǎo)致雄激素水平升高并發(fā)展為多囊卵巢[3]。而芳香化酶抑制劑可阻斷雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)換，來曲唑是一種非甾體類芳香化酶抑制劑，可阻止體內(nèi)T和雄烯二酮在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)變成E2和雌酮，這是本研究建立大鼠P C O S模型的理論基礎(chǔ)；Vi e i racs等［4］的研究顯示按照1 mg/(k g·d)來曲唑?qū)?1日齡大鼠進行灌胃，每只大鼠均飼以高脂高糖飼料并給予5%葡萄糖水，共21天，大鼠體質(zhì)量明顯增加，并表現(xiàn)出明顯的糖耐量受損，提示此種方法構(gòu)建的模型可能存在I R。

3.1.2 采用左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合HCG組 先以左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒抑制下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的功能，致使性激素分泌處于較低水平狀態(tài)，抑制排卵，再利用H C G發(fā)揮L H的作用致卵巢多囊改變和一系列內(nèi)分泌方面的改變[5]。Gom p e l A等[6]采用該法造模后在用藥第9天測量相關(guān)指標(biāo)模型組與對照組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型組血清F IN S、FB G、H OM A指數(shù)均顯著高于對照組，提示此種方法構(gòu)建的模型表現(xiàn)明顯的I R。

3.1.3 脫氫表雄酮(DHEA)造模法 Y a n等[7]測得胰島素樣生長因子1(IG F-1)在模型組卵巢顆粒細胞中高表達。王玉榮等[8]在此種方法模型中測得血清胰島素IN S、IG F-1明顯高于對照組。上述學(xué)者研究結(jié)果顯示此模型符合P C O S表現(xiàn)特征存在I R。

3.2 對 PCOS伴IR大鼠模型的有關(guān)評價

為進一步研究人類P C O S伴I R發(fā)病機制并探索有效治療方法，建立理想的動物模型十分必要。由于對P C O S伴I R本身的發(fā)病機制仍然不清楚，因此建立一個能完全模擬P C O S伴I R病理表現(xiàn)的動物模型還有一定難度。迄今為止已經(jīng)建立了幾種P C O S伴I R動物模型，但是僅能在某些方面模擬P C O S伴I R的臨床特征，而且有些模型建立的機制與P C O S伴I R的發(fā)病有本質(zhì)區(qū)別，因此在這些動物模型上得出的結(jié)論在人類無法較好地推廣。本研究分別采用來曲唑、左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合H C G、脫氫表雄酮誘導(dǎo)大鼠P C O S伴I R模型。結(jié)果可見：來曲唑造模組(B組)與對照組(A組)比較，B組較A組血清F S H、F IN S及T濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；B組血清L H濃度較A組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，此模型符合P C O S表現(xiàn)特征，存在I R。左旋18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合H C G(D組)與對照組(C組)比較，D組血清L H、E2濃度較C組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；D組T濃度較C組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，此模型亦符合P C O S表現(xiàn)特征，對于I R的存在也有一定的意義。這些與P C O S伴I R患者的臨床內(nèi)分泌改變相符。對照組卵巢局部形態(tài)基本正常，各造模組卵巢局部均可見多囊樣改變，基本符合P C O S病理特征。而脫氫表雄酮組在注射第7天時出現(xiàn)大鼠頸背部蛻皮（原因不明），已不適合繼續(xù)實驗，故此組全部處死，中途剔除，可能的原因有：1)所選用的藥物難以溶解，注射的過程難度較大；2)所選用的藥物配置濃度有誤，對大鼠體質(zhì)過敏。

綜上所述，采用來曲唑或左旋-18甲基炔諾酮硅膠棒聯(lián)合H C G建立P C O S伴I R大鼠動物模型，不論在影響血清性激素方面，還是在血糖、胰島素及卵巢局部形態(tài)學(xué)方面均與臨床相接近，符合動物P C O S伴I R造模要求。

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InfluenceofD ifferentModel-Making Methods on the RatsModelsSuffering from Polycystic Ovarian Syndrom e and Insulin Resistance

LIMingming1,PANWen2△,KANG Kaibiao2
1 Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China; 2 Gansu Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To test the relativehormones in serum,fasting plasma glucose(FPG),fast insulin(FINS) and to observe localmorphological changes of the ovary of rats after establishing SD ratsmodelsw ith polycystic ovarian syndrome(PCOS)and insulin resistance(IR)by using different inducing methods.Methods:Letrozole, dehydroepiandrosterone,silastic capsule of levonorgestrel subdermal together w ith HCG were used to induce rats models w ith PCOS and IR.ELISA method was adopted to test the levels of LH、FSH、E2、T and FINS in serum. Glucometer was used to test FPG.Localmorphological structure of ovary was observed through lightm icroscope after HE coloration.Results:Comparedw ith group A(the controlgroup),the density of FSH、FINSand T increased in group B(induced by Letrozole)and the differencewas of statistical significance(P＜0.05).Compared w ith group A,the density of LH in serum of group B increased significantly and the difference was of great statistical significance(P＜0.05).Compared w ith group C (the controlgroup),the densitiesof LH and E2of group D(induced by silastic capsule of levonorgestrel subdermal together w ith HCG)increased and the difference was of statistical significance(P＜0.05).Compared w ith group C,the density of T of group D increased significantly and the differencewasofgreatstatisticalsignificance(P＜0.05).Group E(induced by dehydroepiandrosterone)failed during the experimentand was deleted.In Group A and C,the localmorphologicalstructure of the ovarieswere normaland mature folliclesand dom inant follicle could be seenwhile in group B and D,no dom inant follicles could be seen and polycystic ovaries could be seen.Conclusion:In terms of the influence on serum hormones,FPG and FINS or the localmorphologicalchangesof the ovary,the ratsmodelsw ith PCOSand IR induced by Letrozole or silastic capsule of levonorgestrelsubdermal togetherw ith HCG show sim ilar symptomsas those in the clinic.So thesemethodsmeet the requirementofmaking animalmodelsw ith PCOSand IR.

modelmakingmethod;ratmodelw ith PCOSand IR;hormone level,morphologicalstructure of the ovary

R285.5

A

1004-6852(2015)04-0011-04

2015-02-27

國家自然科學(xué)基金(編號81360604)；甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃項目（編號1305TCYA029）。

李明明(1986—)，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)婦科血瘀證。

△通訊作者：潘文(1963—)，女，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，甘肅省領(lǐng)軍人才，甘肅省555創(chuàng)新人才，甘肅省衛(wèi)生廳中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人，中華中醫(yī)藥學(xué)會理事，中華中醫(yī)藥學(xué)會編輯出版分會副主任委員，中華中醫(yī)藥學(xué)會科普分會副主任委員，中華中醫(yī)藥學(xué)會文化分會常務(wù)理事，甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會副會長兼副秘書長，甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會文化專業(yè)委員會副主任委員兼秘書長，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會主任委員。研究方向：補腎活血法治療多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗的機理研究。