朱 玲，鄭 健，楊 涓，安泓汋，王 晶，龍 君，朱立軍

川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道56號(hào) 610066

微波輔助甲酯化-快速GC 法測(cè)定煙草中的多元酸和高級(jí)脂肪酸

朱 玲，鄭 健，楊 涓，安泓汋，王 晶，龍 君，朱立軍*

川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道56號(hào) 610066

建立了同時(shí)檢測(cè)煙草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸）和高級(jí)脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸）的微波輔助甲酯化-快速氣相色譜（GC）分析方法，并測(cè)定了烤煙及雪茄煙各10個(gè)煙葉樣品中的多元酸和高級(jí)脂肪酸含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。結(jié)果表明：①最優(yōu)前處理?xiàng)l件為衍生化試劑10%硫酸-甲醇溶液，微波功率以20W/s的速率升高至1200W（保持1 m in），萃取劑二氯甲烷。②快速GC分析時(shí)間為8．81m in，目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（r2＞0．99），加標(biāo)回收率在83．18%～114．17%之間，精密度（RSD）小于5%。③烤煙煙葉和雪茄煙煙葉中有機(jī)酸含量差異較大，其中烤煙煙葉中多元酸（除蘋果酸外）含量低于雪茄煙煙葉，高級(jí)脂肪酸（除硬脂酸外）含量高于雪茄煙煙葉。該方法快速、準(zhǔn)確，適用于測(cè)定煙草中的多元酸和高級(jí)脂肪酸含量。

煙草；微波輔助甲酯化；快速氣相色譜（GC）；多元酸；高級(jí)脂肪酸

煙草中的非揮發(fā)性多元酸和高級(jí)脂肪酸占煙葉質(zhì)量的10%左右，其種類和含量是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一［1］。多元酸能與生物堿結(jié)合成鹽，調(diào)節(jié)質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿比例，從而影響煙葉的勁頭和吸味，其中蘋果酸、檸檬酸、草酸等多元酸還是卷煙加料的常用成分，可以調(diào)節(jié)卷煙煙氣pH、增加煙氣濃度、改善吸味、使煙氣醇和［2］。飽和高級(jí)脂肪酸會(huì)增加煙氣的脂肪或蠟味，亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸則會(huì)增加刺激性［3］。因此，分析多元酸和高級(jí)脂肪酸的種類及含量對(duì)了解煙葉的內(nèi)在質(zhì)量和改進(jìn)卷煙配方具有重要的指導(dǎo)意義。目前，多元酸和高級(jí)脂肪酸的檢測(cè)常用硫酸-甲醇作為衍生化試劑直接甲酯化，然后進(jìn)行氣相色譜(GC)分析［1,3-7］。由于甲酯化反應(yīng)大多采用室溫靜置或加熱回流的方法，GC法主要使用常規(guī)色譜柱，因而存在甲酯化反應(yīng)及色譜分析樣品耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、檢測(cè)效率較低等問(wèn)題。微波加熱具有滲透力強(qiáng)、升溫速率快、加熱效率高等特性［8-9］，能顯著提高有機(jī)酸的提取和酯化效率；快速GC采用微孔毛細(xì)管短柱，能顯著縮短色譜分析時(shí)間［10］，適合大量樣品的快速分析。因此，建立了微波輔助甲酯化-快速GC測(cè)定煙草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸）和高級(jí)脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸）的分析方法，旨在為煙草中多元酸和高級(jí)脂肪酸的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

國(guó)內(nèi)外烤煙及雪茄煙煙葉樣品各10個(gè)，均由川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心提供。其中烤煙煙葉樣品生產(chǎn)年份均為2012年，雪茄煙煙葉樣品為2009—2011年。

二氯甲烷（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical公司）；甲醇、硫酸（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。草酸（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸、一水合檸檬酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），己二酸（內(nèi)標(biāo)，日本TCI公司），硬脂酸（瑞士Fluka公司），棕櫚酸（德國(guó)Merck公司），亞油酸（比利時(shí)Acros公司），以上標(biāo)樣純度均大于98%。

HP6890型氣相色譜/HP5973質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Multiwave PRO微波樣品制備儀（奧地利Anton Paar公司）；MS204S電子天平（感量：0.000 1g，瑞士Mettler Toledo公司）；3K-15離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；Milli-Q Direct 16純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：取1.60 g己二酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，配制一級(jí)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；取一級(jí)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10mL，用甲醇稀釋至100m L，得到二級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液，于4℃冰箱中保存。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱取2.50 g蘋果酸、2.50 g檸檬酸、0.60 g丙二酸、0.10 g反丁烯二酸、0.10 g棕櫚酸、0.10 g亞油酸、0.03 g琥珀酸、6.55 g蘋果酸和0.02 g硬脂酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，得到有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別移取0.25、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mL有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于7只25mL容量瓶中，加入2.5mL一級(jí)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液后用甲醇定容，得到有機(jī)酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 衍生化試劑的配制

衍生化試劑為硫酸-甲醇溶液，反應(yīng)時(shí)加入己二酸（內(nèi)標(biāo)）的甲醇溶液用于內(nèi)標(biāo)法定量分析。硫酸-甲醇溶液比例均表示為1.5體積硫酸-甲醇溶液和1體積內(nèi)標(biāo)甲醇溶液混合后硫酸的終含量（體積分?jǐn)?shù)）。根據(jù)比例分別配制得到硫酸終含量為1%、2%、4%、6%、8%、10%和12%的硫酸-甲醇溶液。

1.2.2 樣品預(yù)處理及衍生化

將煙葉抽去煙梗，40℃下干燥2 h，粉碎，過(guò)0.42 mm（40目）篩備用。采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定煙葉含水率［11］。取0.1 g煙末于50mL微波反應(yīng)管中，依次加入1mL二級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液和1.5 mL硫酸-甲醇溶液（硫酸含量10%），24管同時(shí)進(jìn)行微波輔助衍生化處理，微波功率以20 W/s的速率升高至1 200W，并保持1 min；反應(yīng)畢，冷卻至室溫，加入5mL水和3mL二氯甲烷，充分振蕩萃取，置于離心管中以5 000 r/min速率離心8 min；取上清液，過(guò)濾后進(jìn)行快速GC-FID和GC-MS分析。分析條件為：

色譜柱：DB-17熔融石英毛細(xì)管柱（10 m× 0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：He，0.4mL/min；進(jìn)樣量：1μL，分流比187∶1；升溫程序：；FID 檢測(cè)器溫度：275℃；H2：40mL/min；空氣：450mL/m in；He：30mL/min；信號(hào)采集頻率：100 Hz；MS傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：230℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；掃描范圍：35～450 amu。

完全出露型孤石與疊孤石公式相同，但穩(wěn)定性并不相同，從公式(3)看，抗滑移能力主要與各自的摩擦系數(shù)有關(guān)，摩擦系數(shù)越大，抗滑移能力也就越強(qiáng)。由于完全出露孤石無(wú)懸空部分，所以完全出露型孤石與疊孤石相比不存在中心外移情況，公式(4)中x值也就更大，抗傾覆能力也就更好。故完全出露的孤石抗滑性由孤石與坡面的摩擦系數(shù)決定，抗傾覆性優(yōu)于疊孤石。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照定性各化合物，對(duì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及NIST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果定性；內(nèi)標(biāo)法定量分析。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)烤煙及雪茄煙煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 硫酸-甲醇比例的選擇

有機(jī)酸衍生化常采用硫酸-甲醇作為衍生化試劑，通過(guò)酸性條件下有機(jī)酸的酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)，使有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的有機(jī)酸甲酯［5］。在本研究中，分別采用硫酸含量為0、1%、2%、4%、6%、8%、10%及12%的硫酸-甲醇作為衍生化試劑篩選最優(yōu)的硫酸-甲醇比例，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（圖1）顯示，在相同的微波反應(yīng)條件下，隨著硫酸含量的增加，各有機(jī)酸的色譜峰面積明顯增加，表明硫酸比例對(duì)有機(jī)酸的酯化程度有較大的影響，蘋果酸和己二酸（內(nèi)標(biāo)）在硫酸含量為2%時(shí)基本反應(yīng)完全，而大多數(shù)有機(jī)酸在硫酸含量為10%時(shí)均反應(yīng)完全，當(dāng)硫酸含量繼續(xù)增加時(shí)，棕櫚酸、亞油酸峰面積小，因此選擇10%硫酸-甲醇溶液作為衍生化試劑。

2.1.2 微波條件的優(yōu)化

2.1.3 萃取劑的選擇

有機(jī)酸衍生物的常用萃取溶劑有二氯甲烷、正己烷、正戊烷、乙酸乙酯等［4-5,12］，因此選擇這4種溶劑進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二氯甲烷萃取快速且效率高；乙酸乙酯萃取過(guò)程中部分樣品發(fā)生乳化難以分層；正己烷、正戊烷萃取率較低。因此選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

圖1 硫酸-甲醇比例對(duì)煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 色譜條件的選擇

有機(jī)酸的檢測(cè)多采用DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色譜柱［1,13］及與其性質(zhì)相近的HPU ltra 2色譜柱［4］，但此類色譜柱無(wú)法完全分離分子結(jié)構(gòu)和極性均相近的油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯，且分析時(shí)間長(zhǎng)（通常超過(guò)1 h）。據(jù)文獻(xiàn)［14］報(bào)道，DB-17（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色譜柱能有效分離油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯。為提高分析效率、縮短檢測(cè)時(shí)間，選用內(nèi)徑更小、柱長(zhǎng)更短的DB-17（10 m×0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）色譜柱進(jìn)行快速GC分析。結(jié)果（圖3）顯示，采用DB-17微孔短柱分離時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯及亞麻酸甲酯的分離，且色譜峰峰型較好，色譜分析時(shí)間僅需8.81min。

圖2 微波條件對(duì)煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸測(cè)定結(jié)果的影響

圖3 多元酸和高級(jí)脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜圖

2.3 煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸的定性結(jié)果

分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、烤煙及雪茄煙樣品進(jìn)行GC-FID和GC-MS分析，色譜峰定性結(jié)果如圖3所示。其中沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物定性結(jié)果如表1所示，表明烤煙和雪茄煙煙葉樣品中均含有油酸和亞麻酸［4,15］，另外此方法還能檢測(cè)到一定量的4-氧代-戊酸［16-17］和2,4-庚二烯酸［18-19］。

2.4 工作曲線和檢測(cè)限

分別對(duì)7個(gè)不同質(zhì)量濃度的多元酸和高級(jí)脂肪酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行微波輔助衍生化和快速GC分析，采用內(nèi)標(biāo)法定量，以各有機(jī)酸與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）對(duì)其相應(yīng)濃度比（X）進(jìn)行回歸分析，得到各有機(jī)酸的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)（表2）。由表2可知，各多元酸和高級(jí)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋并進(jìn)行快速GC分析，以3倍信噪比為方法的檢出限（LOD），結(jié)果（表2）表明本方法具有較高的靈敏度，適合于定量分析。

表1 煙葉樣品部分有機(jī)酸的定性結(jié)果

表2 多元酸和高級(jí)脂肪酸的工作曲線、相關(guān)系數(shù)、LOD、回收率和精密度 （n=6）

2.5 回收率與精密度

分別以烤煙和雪茄煙作為分析對(duì)象進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定方法的回收率，取烤煙和雪茄煙樣品各1個(gè)，進(jìn)行低、中、高3種不同濃度水平的加標(biāo)處理，衍生化后進(jìn)行快速GC分析，計(jì)算其加標(biāo)回收率。結(jié)果（表2）顯示：加標(biāo)回收率為83.18%～114.17%，RSD為1.59%～4.93%，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均較好，可以滿足定量需要。

2.6 與傳統(tǒng)方法測(cè)定結(jié)果的比較

通常，有機(jī)酸和不飽和脂肪酸分析方法中衍生化時(shí)間為22～24 h，樣品分析時(shí)間為65 m in［3-4］，而采用本方法可同時(shí)微波輔助衍生化24個(gè)樣品，時(shí)間為2min，樣品色譜分析時(shí)間僅8.81 min，檢測(cè)效率大幅提升。對(duì)本方法和傳統(tǒng)方法［4］測(cè)定結(jié)果（表3）進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用本方法的測(cè)定結(jié)果與采用傳統(tǒng)方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），且與文獻(xiàn)報(bào)道［4,6,20-21］的煙葉樣品中多元酸和高級(jí)脂肪酸的含量范圍一致。

表3 本方法與傳統(tǒng)方法測(cè)定結(jié)果的比較 （mg·g-1）

2.7 樣品分析結(jié)果

采用本方法分別測(cè)定了10個(gè)烤煙和10個(gè)雪茄煙煙葉樣品，結(jié)果如表4和表5所示。對(duì)烤煙煙葉和雪茄煙煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸含量進(jìn)行獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)。結(jié)果表明，不同煙葉樣品中多元酸和高級(jí)脂肪酸含量差異較大，其中雪茄煙煙葉中的多元酸含量（除蘋果酸外）顯著高于烤煙煙葉（P＜0.05），尤其是草酸和檸檬酸；而烤煙煙葉中高級(jí)脂肪酸（除硬脂酸外）含量顯著高于雪茄煙煙葉（P＜0.05）。

表4 烤煙煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸含量① （mg·g-1）

表5 雪茄煙煙葉中多元酸和高級(jí)脂肪酸含量 （mg·g-1）

3 結(jié)論

建立了微波輔助甲酯化-快速氣相色譜分析煙草中多元酸和高級(jí)脂肪酸含量的方法，本方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于煙草樣品中多元酸和高級(jí)脂肪酸的快速檢測(cè)?？緹熀脱┣褵煙熑~中的有機(jī)酸含量差異較大，烤煙煙葉中的多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸及檸檬酸）含量明顯低于雪茄煙煙葉，高級(jí)脂肪酸（棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸）含量明顯高于雪茄煙煙葉。

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責(zé)任編輯 洪廣峰

Determination of Polybasic Acids and Higher Fatty Acids in Tobacco by Microwave-assisted Methyl Esterification Combining with Fast GC

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,AN Hongyue,WANG Jing,LONG Jun,and ZHU Lijun*
Research&Development Center,China Tobacco Chuanyu Industrial Co.,Ltd.,Chengdu 610066,China

A method combining m icrowave-assisted derivatization with fast gas chromatography(GC)was developed for rapidly determ ining the contents of polybasic acids(oxalic acid,malonic acid,fumaric acid, succinic acid,malic acid and citric acid)and higher fatty acids(palm itic acid,stearic acid and linoleic acid)intobacco,and the contents of these acids inten flue-cured tobacco samples and ten cigar filler tobacco sam ples were determ ined.The resu lts showed that：1)The op timal pretreatment conditions were using 10%sulfuric acid-methanol as esterification reagent and CH2Cl2as extraction agent while the power of m icrowave increased at a rate of 20 W/s to 1200 W(remaining for 1 m in).2)The time for fast GC analysis was 8.81 m in,the calibration curves of target com pounds displayed good linearity(r2＞0.99),the standard addition recoveries ranged from 83.18%to 114.17%with RSD less than 5%.3)The contents of organic acids in flue-cured tobacco and cigar filler tobacco were quite different,the contents of polybasic acids(excluding malic acid)were higher in cigar filler tobacco,while the contents of higher fatty acids (excluding stearic acid)were higher in flue-cured tobacco.This method is rapid,accurate and suitable for the determ ination of po lybasic acids and higher fatty acids intobacco.

Tobacco;Microwave-assisted methyl esterification;Fast GC;Polybasic acid;Higher fatty acid

TS411.1

A

1002-0861（2015）09-0056-07

10.16135/j.issn1002-0861.20150910

2014-11-21

2015-04-17

四川省科學(xué)技術(shù)廳基金項(xiàng)目“光譜分析技術(shù)在卷煙主要輔助材料質(zhì)量監(jiān)控中的應(yīng)用研究”（2013JYZ004）。

朱玲（1987—），女，碩士，助理工程師，主要從事煙草化學(xué)分析研究。E-mail：zhuling@cytobacco.com；*

朱立軍，E-mail：zhulj7802@163.com

朱玲，鄭健，楊涓，等.微波輔助甲酯化-快速GC法測(cè)定煙草中的多元酸和高級(jí)脂肪酸［J］.煙草科技，2015，48（9）：56-61，74.

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,etal.Determ ination of polybasic acids and higher fatty acids in tobacco by m icrowave-assisted methyl esterification combining with fast GC［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：56-61，74.