熊娟　蔡大川　張志軍　黃啟紅

摘要：上世紀(jì)80年代中期，分子生物學(xué)領(lǐng)域誕生了一項(xiàng)新技術(shù)，稱作DNA體外擴(kuò)增法，簡(jiǎn)稱為PCR技術(shù)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，自誕生之日起，其實(shí)用性在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到了很好的印證。本文重點(diǎn)介紹一下PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：PCR 原理與技術(shù) 食品檢驗(yàn) 應(yīng)用

中圖分類號(hào)：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）02-0038-01

1 引言

上世紀(jì)80年代中期，分子生物學(xué)領(lǐng)域誕生了一項(xiàng)新技術(shù)，稱作DNA體外擴(kuò)增法，簡(jiǎn)稱為PCR技術(shù)。其基本原理是在生物體的體外，對(duì)指定DNA雙鏈片斷進(jìn)行擴(kuò)增。第一步：挑選出指定DNA雙鏈片斷，人工合成指定DNA雙鏈片斷端頭鄰近序列互補(bǔ)的寡核苷酸片斷，將該互補(bǔ)片段稱作引物（Primer），引物也是雙鏈結(jié)構(gòu)，分作左端引物和右端引物。第二步：加熱指定DNA雙鏈片斷，使之發(fā)生變性，分裂成單鏈，把左右引物與之分別配對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合。第三步：在DNA聚合酶和4種dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA鏈按5/→3/方向延伸，合成DNA雙鏈，這個(gè)步驟被稱為DNA多聚酶鏈反應(yīng)。第四步：以新合成的DNA雙鏈作為擴(kuò)增模板，重復(fù)DNA多聚酶鏈反應(yīng)步驟。歷經(jīng)25～35次循環(huán)，可將DNA序列擴(kuò)增到近百萬(wàn)倍。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，自誕生之日起，其實(shí)用性在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到了很好的印證。

2 PCR技術(shù)在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.1 PCR技術(shù)的檢測(cè)原理

PCR技術(shù)最根本的鑒定依據(jù)是生物的DNA結(jié)構(gòu)具有唯一性。在食品檢測(cè)中，起到鑒定標(biāo)準(zhǔn)模板作用的是引物，從理論上說(shuō)，①如果引物來(lái)自DNA保守區(qū)，則在擴(kuò)增之后，所有被檢測(cè)對(duì)象都含有DNA保守區(qū)的片段；②如果引物來(lái)自DNA特異區(qū)，則在擴(kuò)增之后，所有被檢測(cè)對(duì)象都含有DNA特異區(qū)的片段。以上兩種理論依據(jù)就是PCR技術(shù)的檢測(cè)原理。

在實(shí)際應(yīng)用中，人工有選擇地截取DNA片段，使用DNA多聚酶鏈反應(yīng)，可以在2～3小時(shí)之內(nèi)達(dá)到常規(guī)檢測(cè)需要數(shù)天才能達(dá)到的培養(yǎng)效果，另外還省去了繁瑣的種屬鑒定等工作，簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程。

2.2 PCR技術(shù)的操作程序

（1）待檢樣品的濃集（增菌）。食品中待檢的微生物群落濃度一般都是比較低的，達(dá)不到檢測(cè)要求。這就需要進(jìn)行待檢微生物的濃集。

（2）核酸的提取。為了實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，必須提取待檢樣品的核酸。常用的處理方法包括：加熱、反復(fù)凍融、化學(xué)裂解。

（3）PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，最關(guān)鍵的莫過(guò)于引物，它直接關(guān)系到PCR檢測(cè)的成敗。擴(kuò)增需要20—40個(gè)反應(yīng)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都由高溫變性、低溫退火、適溫延伸組成。高溫時(shí)，氫鍵打開，雙鏈變?yōu)閱捂?，生成擴(kuò)增模板；低溫時(shí)，左引物和右引物分別與模板DNA的2條單鏈做互補(bǔ)結(jié)合，完成配對(duì)；適溫時(shí)，在聚合酶作用下，4種三磷酸脫氧核苷（A、T、G、C）按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷進(jìn)行配對(duì)添加，按5/→3/方向自動(dòng)合成新的DNA雙鏈片段。

變性溫度一般需保持在94℃左右，如果待擴(kuò)增區(qū)域DNA的G+C含量太高，則可考慮適當(dāng)提高變性溫度。

退火溫度與引物的G+C含量有關(guān)，根據(jù)公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。

延伸溫度一般需保持在72℃左右，此時(shí)DNA聚合酶的聚合速度約1000（堿基）/min。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。常用的檢測(cè)方法為瓊脂糖凝膠電泳法，瓊脂糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.8%～2%之間。待分離DNA片斷的分子量越小，所需瓊脂糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則越大，反之亦然。

3 PCR技術(shù)用于食品檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)檢測(cè)方法多采用平板培養(yǎng)法，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)來(lái)判斷菌體濃度。傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，其最大的缺點(diǎn)是消耗的時(shí)間太長(zhǎng)，檢測(cè)周期一般在3——10天。

PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是檢測(cè)速度快，使用特異區(qū)擴(kuò)增檢測(cè)，只要在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)成功擴(kuò)增，即可檢驗(yàn)并判斷出待檢測(cè)樣品的種類，非常迅捷、靈敏。

3.2 PCR技術(shù)的缺點(diǎn)

任何事物都不是完美的，PCR技術(shù)一樣存在缺點(diǎn)，正是這些缺點(diǎn)的存在，導(dǎo)致其不能完全取代傳統(tǒng)檢測(cè)法。其主要缺點(diǎn)包括：（1）假陽(yáng)性問(wèn)題。核酸受到污染而造成假陽(yáng)性的問(wèn)題，是PCR技術(shù)的最大缺點(diǎn)。這個(gè)缺點(diǎn)來(lái)自擴(kuò)增本身，在擴(kuò)增的過(guò)程中，即使只有一個(gè)污染源，結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)成十萬(wàn)成百萬(wàn)倍的污染現(xiàn)象，造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性，稱之為假陽(yáng)性。

防止假陽(yáng)性問(wèn)題，目前只有做好隔離這一種辦法。（2）假陰性問(wèn)題。假陽(yáng)性問(wèn)題來(lái)自PCR技術(shù)本身，假陰性問(wèn)題則來(lái)自待測(cè)樣品。食品成分復(fù)雜，其中多種成分發(fā)生了復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，不能排除模板液中帶有某種或某些抑制PCR反應(yīng)的成分。防止假陰性問(wèn)題的辦法是設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照環(huán)節(jié)。（3）定量檢測(cè)困難。由于影響PCR產(chǎn)率的原因比較多，在定量檢測(cè)方面不能提供較為精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致PCR技術(shù)無(wú)法勝任定量檢測(cè)。直至目前，尚沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的突破與進(jìn)展，限制了PCR技術(shù)在檢測(cè)方面的應(yīng)用范圍。

4 結(jié)論

PCR檢測(cè)有一定的局限性，但是，其高靈敏度的檢測(cè)反應(yīng)、明顯的特異性辨別、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)流程，是其它檢測(cè)方法所不能替代的。相信隨著生物技術(shù)的快速進(jìn)步，PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍會(huì)越來(lái)越廣泛。

參考文獻(xiàn)

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