摘 要：對于使用激光掃描共聚焦顯微鏡的研究者來說，實驗設計、樣品準備、儀器操作和后期圖片處理是一個實驗至關重要的四步，前兩步是任何一個研究者都必須具備的能力，否則無從談起上機實驗，后期圖片處理無非就是修飾潤色使圖片從視覺上更美觀，而對大多數(shù)從事生物學醫(yī)學領域的研究者來說，儀器的操作可能是最關鍵的一步，而儀器操作中光路的設置和不同掃描模式的選擇可能是最難掌握和最難學習的模塊，因為這部分可能涉及一些物理光譜學的知識。文章就以自己實驗室Zeiss LSM 780激光掃描共聚焦顯微鏡為例，簡要介紹其三種光路設置和五種不同掃描模式如何選擇使用，希望對使用者有所幫助。

關鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；光路設置；掃描模式

引言

隨著現(xiàn)代科學技術的飛速發(fā)展，各種熒光蛋白、熒光染料和精密光學元件不斷出現(xiàn)[1-5]，激光掃描共聚焦顯微鏡技術得到了極大的發(fā)展，各種公司，各種型號的共聚焦系統(tǒng)不間斷問世或完善，廣泛應用在細胞生物學醫(yī)學領域[6-8]。廣泛的應用使得這一設計精密又操作復雜的儀器必須讓有需要的研究者方便學習和掌握。就以蔡司公司為例，科學技術的發(fā)展和適應市場的需要，不同型號的共聚焦系統(tǒng)逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技術提高的同時，操作軟件也在一步步簡化。文章以華南農(nóng)業(yè)大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室的一臺超高靈敏度檢測Zeiss LSM 780系統(tǒng)為例，介紹其光路設置和不同掃描模式的選擇，因為它是目前蔡司公司推出的上述普通激光掃描共聚焦顯微鏡中型號最高的一款，它的光路設置和掃描模式的配置將集上述所有型號系統(tǒng)的內(nèi)置設置于一身，希望能給實驗者提供較全面的指導。

1 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡三種光路設置

（1）最“傻瓜式”一鍵操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011軟件，軟件操作界面有一個Resue按鈕。如果使用者在此之前在這臺儀器上做過同樣的實驗或本次實驗與之前某次實驗使用的熒光標簽一樣或光譜數(shù)據(jù)類似，并且在此儀器上還保留有實驗數(shù)據(jù)，那只需在操作軟件中打開之前的一張圖片，然后點擊Reuse按鈕，軟件將自動完成光路配置，并且光路中所有參數(shù)都是你打開的那張圖片的參數(shù)。（2）“傻瓜式”操作：如果使用者第一次使用該儀器，或本次實驗與前面實驗不使用同樣或光譜數(shù)據(jù)類似的熒光標簽，又或者使用同樣的標簽但在此儀器上沒有存留實驗數(shù)據(jù)，那么需要在操作界面中找到一個Smart Setup按鈕，點擊打開Smart Setup對話框，在Configure your experiment表格中，在Dye列表下直接選擇熒光物質名稱或在Search中輸入儀器自身存儲的熒光物質的英文名稱，然后選擇它；在color列表下選擇偽彩色，然后點擊Apply，軟件將自動完成光路配置，包括選擇相應的激發(fā)光，主分光片，檢測PMT和收集熒光信號的發(fā)射帶寬，并將激光強度調(diào)至2.0。（3）手動設置：對大多數(shù)實驗者來說，這是最難的一種情況。如果你在“傻瓜式”操作步驟中Search不到你所使用的熒光物質名稱（儀器自身存儲的熒光物質名稱畢竟有限，并且新的熒光物質和染料的開發(fā)也在不斷進行中），并且也不知道它和哪種常見的熒光物質的光譜數(shù)據(jù)相似，那么怎么辦你需要手動設置光路，首先你需要查詢到你所使用的熒光物質的光譜數(shù)據(jù)，包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜助你選擇合適的激發(fā)光來激發(fā)你的熒光物質發(fā)出熒光，發(fā)射光譜指導你選擇合適的接收波長來接收發(fā)射的熒光，一般來說選擇激發(fā)峰附近的激發(fā)波長的激光來作為激發(fā)光，發(fā)射峰附件的波段作為接收熒光的波段最合適。

2 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡四種面掃描模式

使用兩種或兩種以上的熒光物質時需要注意熒光物質的光譜串色問題。在點擊Apply按鈕前，四種備選的面掃描模式供使用者選擇。

（1）Fastest：在各熒光物質的發(fā)射光譜不完全重疊的情況下，同時掃描多種熒光物質，即在一個Track里多條激光線同時掃描，掃描成像速度是最快的，但可能出現(xiàn)信號串擾。（2）Best Signal：針對不同熒光物質逐一進行掃描成像，即一種熒光物質使用一個Track，每條激光線順序掃描。盡可能減少各種熒光物質發(fā)射光譜間的串擾，但掃描成像速度會明顯降低。（3）Best Compromise：綜合考慮成像速度和信號質量，同時掃描發(fā)射光譜重疊較少的熒光物質，即發(fā)射光譜重疊較少的熒光物質使用一個Track，另一種物質單獨使用一個Track。在減少信號串擾的前提下，在一定范圍內(nèi)提高成像速度。（4）Linear Unmixing：進行多通道熒光掃描的光路設定，用于簡單的光譜拆分。

3 Zeiss LSM 780 激光掃描共聚焦顯微鏡一種“隱藏”的線掃描模式

軟件默認的掃描模式一般為面掃描模式，即在一個track完成整幅圖像的掃描后，切換至下一個track完成掃描，直至完成全部掃描。但對于活動樣品來講，例如剛游離或濃度小的植物原生質體樣品，在面掃描模式下，可能出現(xiàn)由于各Track掃描時間上的延遲而使各通道熒光信號無法完全重疊的現(xiàn)象。此時我們需要發(fā)現(xiàn)一種“隱藏”的線掃描模式，即一個track沿X軸方向完成一行掃描后，切換至下一個track完成掃描，直至所有track均完成此行掃描，掃描系統(tǒng)再移動至下一行。如此重復，直至完成全部掃描。這種掃描方式盡可能地降低了各Track掃描時間上的延遲，為活動樣品的掃描提供了解決方式。

參考文獻

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[2]王春梅，黃曉峰，楊家驥，等.激光掃描共聚焦顯微鏡技術[M].西安：第四軍醫(yī)大學出版社，2004.

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作者簡介：李華麗（1986-），女，漢族，河南人，碩士，實驗員，主要從事科研儀器設備使用與實驗室管理。