王宇等

摘 要：文章對(duì)兩株錦雞兒根瘤菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生理生化特性進(jìn)行比較研究，通過回接實(shí)驗(yàn)分析兩株根瘤菌對(duì)錦雞兒植物生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：（1）在YMA培養(yǎng)基上I號(hào)菌株生長(zhǎng)比II號(hào)菌株快；（2）兩菌株細(xì)胞表面成分中纖維素含量都較少；（3）兩菌株的耐鹽能力相同，pH值生長(zhǎng)范圍一致、但生長(zhǎng)的最佳pH值不同；（4）兩菌株對(duì)所測(cè)碳源利用的有差異，對(duì)所測(cè)氮源的利用情況較一致；（5）兩菌株都可以促進(jìn)錦雞兒植株的生長(zhǎng)，其中II號(hào)菌株對(duì)錦雞兒生長(zhǎng)的促進(jìn)作用大于I號(hào)菌株。

關(guān)鍵詞：錦雞兒；根瘤菌；生理生化；回接實(shí)驗(yàn)

錦雞兒屬（Caragana）植物屬于豆科植物、落葉灌木，是歐-亞草原植物亞區(qū)的典型植被。全世界約有100余種，我國(guó)的錦雞兒屬植物主要分布在荒漠區(qū)和草原[1，2]。錦雞兒屬植物具有耐寒耐瘠薄、防風(fēng)固沙、保持水土的能力，可提高土壤肥力、改善土壤結(jié)構(gòu)，在荒漠化生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要角色。李香真等報(bào)道在退化草地恢復(fù)過程中，小葉錦雞兒灌叢誘導(dǎo)了植物組成、生物量和土壤化學(xué)元素含量在空間上的分異，這種生態(tài)效應(yīng)有利于退化草地的恢復(fù)[2-4]。此外，錦雞兒屬植物具有綠肥、燃料、飼料、油脂等資源價(jià)值，在食品、醫(yī)藥、能源、畜牧業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[5，6]。

根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系是已知固氮能力最強(qiáng)的生物固氮體系之一，所固定的氮量占全球生物固氮總量的65%以上[7]。有許多關(guān)于根瘤菌的分類、固氮機(jī)理、與宿主相互作用等的報(bào)道，但研究主要集中在對(duì)大豆、苜蓿、紫云英等草本豆科植物。對(duì)錦雞兒、沙冬青、刺槐等喬木、灌木、半灌木豆科植物根瘤菌資源的研究有些不足[8-10]。錦雞兒屬植物是內(nèi)蒙及西部荒漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與重建的先鋒樹種，錦雞兒植物生態(tài)功能的發(fā)揮與其根瘤固氮作用密切相關(guān)。錦雞兒根瘤固氮作用可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)和植被恢復(fù)，有助于提高群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜性、生物多樣性，保持和恢復(fù)生態(tài)平衡[3，11]。文章對(duì)從錦雞兒根瘤分離的菌株進(jìn)行耐鹽、耐酸堿、碳氮源利用等生理生化特性測(cè)試，并回接錦雞兒研究其對(duì)宿主生長(zhǎng)行為的影響，為實(shí)施退耕還林還草進(jìn)行可持續(xù)性農(nóng)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試根瘤菌I號(hào)菌株和II號(hào)菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理教研室分離、鑒定和保藏。

1.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將I、II號(hào)菌株接種到Y(jié)MA培養(yǎng)基（甘露醇10g、酵母提取粉0.8g，K2HPO4 0.2g、KH2PO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml），28℃條件下培養(yǎng)。每天測(cè)定細(xì)菌的生物量，連續(xù)測(cè)定7天。

1.3 生理生化特性的測(cè)定

1.3.1 剛果紅染色反應(yīng)

將80？滋gml-1剛果紅加入到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基中，滅菌后倒平板。接種供試菌株，28℃條件下培養(yǎng)5天，觀察菌落顏色。

1.3.2 耐鹽性測(cè)試

將NaCl加入到Y(jié)MA培養(yǎng)基中配成濃度為1%、2%、3%、4%、5%和6%等梯度，以不加NaCl的YMA平板培養(yǎng)基為對(duì)照，滅菌后倒平板。接種供試菌株，28℃條件下培養(yǎng)7天后稱量生物量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 耐酸堿性測(cè)試

用HCl和NaOH將YMA培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0等梯度。培養(yǎng)測(cè)量同上。

1.3.4 單一碳源的利用

選用YMA培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)試，利用的碳源分別是：甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，每種碳源加10g/1000ml。培養(yǎng)測(cè)量同上。

1.3.5 單一氮源的利用

選用YMA培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)試，利用的氮源分別是：酵母提取粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、KNO3、NaNO3，每種氮源加0.8g/1000ml，不加氮源為對(duì)照。培養(yǎng)測(cè)量同上。

1.4 回接實(shí)驗(yàn)

錦雞兒種子用75%的酒精處理15min，用30%的H2O2進(jìn)行表面消毒5min后，無菌水沖洗。經(jīng)過消毒的種子置于培養(yǎng)皿中催芽2天，將發(fā)芽的種子栽于花盆中（土壤與蛭石1：1混合）。出苗生長(zhǎng)4周后接種I號(hào)、II號(hào)菌株，每盆接種10ml供試菌株YMA液體培養(yǎng)物，對(duì)照接種10mlYMA液體培養(yǎng)基，每個(gè)處理22個(gè)的重復(fù)，生長(zhǎng)9周后收獲。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納總結(jié)，并根據(jù)計(jì)算的出的平均生物量構(gòu)建圖表；并用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因子方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)特征

供試根瘤菌I號(hào)和II號(hào)菌株的菌落形態(tài)見圖1。圖1I是I號(hào)菌株28℃條件下培養(yǎng)3天的菌落形態(tài)，圖1II是II號(hào)菌株28℃條件下培養(yǎng)5天的菌落形態(tài)，說明I號(hào)菌株的生長(zhǎng)快于II號(hào)菌株。I、II號(hào)菌株的生長(zhǎng)曲線如圖2。I號(hào)菌株第1、2和3天生長(zhǎng)緩慢，為延遲期生長(zhǎng)；第4和5天生長(zhǎng)較快，為對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)；第6和7天生長(zhǎng)緩慢，為衰退期生長(zhǎng)。II號(hào)菌株第1、2、3和4天生長(zhǎng)緩慢，為延遲期生長(zhǎng)；第5天生長(zhǎng)較快，為對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)；第6和7天生長(zhǎng)緩慢，為衰退期生長(zhǎng)。到第7天時(shí)，I和II號(hào)菌株平均生物量的相差0.11g，表明I號(hào)菌株的生長(zhǎng)明顯地比II號(hào)菌株快。

2.2 生理生化特性

剛果紅染色反應(yīng)顯示I號(hào)和II號(hào)菌株菌落呈淺桔黃色，都不吸收剛果紅染料，表明細(xì)胞表面成分中纖維素含量較少。

由耐鹽性測(cè)試可知（表1），在對(duì)照不加NaCl的條件下，I、II號(hào)菌株長(zhǎng)勢(shì)良好；I、II號(hào)菌株均可在1%[Na+]的條件下可以生長(zhǎng)，但它們的生物量顯著低于對(duì)照；在2%-6%[Na ]條件下，I、II號(hào)菌株均不能生長(zhǎng)，表明I、II號(hào)菌株的耐鹽能力相同。

耐酸堿性測(cè)試結(jié)果為I、II號(hào)菌株在pH值為6.0、7.0、8.0、9.0條件下均能生長(zhǎng)，在pH值為3.0、4.0、5.0、10.0、11.0、12.0條件下不能生長(zhǎng)（表1）。從結(jié)果分析可知：I號(hào)菌株在PH=8.0時(shí)生長(zhǎng)的最好，II號(hào)菌株在PH=7.0時(shí)生長(zhǎng)的最好；I號(hào)菌株比II號(hào)菌株耐堿的能力稍強(qiáng)一些。

不同碳源利用測(cè)試中I菌株生物量大小的排列順序?yàn)椋焊事洞?蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉>麥芽糖>乳糖，II號(hào)菌株生物量大小的排列順序?yàn)椋赫崽?甘露醇>葡萄糖>乳糖>可溶性淀粉>麥芽糖（表1）。I、II號(hào)菌株都能較好地利用甘露醇和蔗糖，不能很好地利用乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉。I號(hào)菌株在葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的不好，而II號(hào)菌株在葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的很好，I、II號(hào)菌株對(duì)葡萄糖的利用差異較大。研究結(jié)果表明I、II號(hào)菌株對(duì)所測(cè)碳源利用的有差異。

對(duì)本實(shí)驗(yàn)所測(cè)試的氮源分為無機(jī)態(tài)氮和有機(jī)態(tài)氮兩類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明I、II號(hào)菌株對(duì)所測(cè)氮源的利用情況較一致。兩菌株對(duì)有機(jī)氮的利用都比無機(jī)氮好，其中對(duì)酵母提取粉的利用極其顯著地比其它有機(jī)氮好；其次是酵母膏；蛋白胨、牛肉膏、尿素的利用雖然比酵母提取粉和酵母膏差，但也比對(duì)無機(jī)氮的利用好（表1）。YMA培養(yǎng)基成分中去掉酵母提取粉為無氮素對(duì)照，I、II號(hào)菌株在無氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)比在無機(jī)氮的處理顯著地好。

方差分析表明在0.01水平上，[Na+]、pH值、碳源和氮源對(duì)I和II號(hào)菌株的生長(zhǎng)都具有顯著的影響（表1）。

2.3 對(duì)錦雞兒生長(zhǎng)的影響

接種I號(hào)菌株的22株錦雞兒中有19株根系形成根瘤，根瘤米黃色、橢球狀、大小為1-2.5mm、單株植物的平均結(jié)瘤數(shù)為4.2個(gè)；接種II號(hào)菌株的22株中有20株的根系形成根瘤，根瘤米黃色、球狀、大小為0.5-1mm、單株植物的平均結(jié)瘤數(shù)為6.7個(gè)。從圖3可看出，接種I號(hào)和II號(hào)菌株植株的根系細(xì)、長(zhǎng)、顏色淺，在花盆土壤中分散分布且深扎到花盆土壤底部；對(duì)照植株的根系成簇生長(zhǎng)且較短、顏色深，沒有根瘤形成。

經(jīng)過測(cè)試從表2可知，接種I號(hào)菌株、接種II號(hào)菌株和對(duì)照植株CK的平均株高和地上部分平均生物量從大到小的順序均為：II>I>CK。從方差分析結(jié)果可知，接種I號(hào)菌株、II號(hào)菌株植株的平均株高和地上部分平均生物量都顯著地大于對(duì)照植株，接種II號(hào)菌株植株的平均株高和地上部分平均生物量又顯著地大于接種I號(hào)菌株的植株。接種I號(hào)菌株、接種II號(hào)菌株和對(duì)照植株根系的平均長(zhǎng)度和地下部分平均生物量從大到小的順序也是：II>I>CK（表2）。從方差分析結(jié)果可知，接種I、II號(hào)菌株植株的根系的平均長(zhǎng)度與地下部分平均生物量顯著地大于對(duì)照植株；接種II號(hào)菌株植株的根系平均長(zhǎng)度大于接種I號(hào)菌株植物的根系平均長(zhǎng)度，但差異不顯著；接種II號(hào)菌株植物的地下部分平均生物量顯著地大于接種I號(hào)菌株的植物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明根瘤菌I、II號(hào)菌株是具有結(jié)瘤能力并且可以促進(jìn)的錦雞兒植株的生長(zhǎng)，其中II號(hào)菌株對(duì)錦雞兒生長(zhǎng)的促進(jìn)作用大于I號(hào)菌株。

3 討論

土壤的溫度、含水量、鹽堿性、酸堿度、有機(jī)質(zhì)含量等因素直接影響根瘤菌的生存、生長(zhǎng)、結(jié)瘤和固氮能力[12-17]。Hashem等研究表明土壤鹽離子濃度影響根瘤菌的生存和增殖，影響根瘤共生系統(tǒng)的固氮效率[14]。Herrera等研究認(rèn)為根瘤菌的抗逆性是豆科植物與根瘤菌能否形成有效根瘤的限制因素，也是檢測(cè)根瘤菌生態(tài)適應(yīng)范圍和固氮能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)[15]。不同種屬的根瘤菌對(duì)溫度、酸堿度、鹽堿等脅迫有不同的耐性，同種屬不同地區(qū)根瘤菌分離株對(duì)逆境的忍耐力也有所差異，這可能是由于根瘤菌與相應(yīng)的宿主植物長(zhǎng)期對(duì)生存環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。本研究從鄂爾多斯地區(qū)錦雞兒分離的兩株根瘤菌只能忍耐1%NaCl、pH值生長(zhǎng)范圍在6.0-9.0之間；王衛(wèi)衛(wèi)等分離新疆錦雞兒屬植物的兩株根瘤菌菌株可忍耐NaCl的濃度分別為2%和3%，可在pH值為4.0-5.0和10.0的條件下生長(zhǎng)[16]，可以看出新疆錦根瘤菌比鄂爾多斯根瘤菌抗逆性更強(qiáng)些?？赡苁怯捎谛陆貐^(qū)基本上屬于干旱荒漠土壤、又嚴(yán)重的鹽堿化，高溫、干旱、鹽堿和溫度變化劇烈為新疆干旱地區(qū)生態(tài)條件的顯著特征，這些生態(tài)環(huán)境中逆性因素對(duì)當(dāng)?shù)馗鼍L(zhǎng)期的自然選擇，使得根瘤菌可適應(yīng)在該地區(qū)嚴(yán)重鹽堿化荒漠土壤中生存，關(guān)桂紅等報(bào)道從新疆地區(qū)其他豆科植物根瘤分離的根瘤菌多數(shù)具有較強(qiáng)的耐鹽性、耐酸堿、耐高溫等抗逆能力[17]。

本研究結(jié)果證明，接種I號(hào)、II號(hào)菌株植株的根系較對(duì)照植株長(zhǎng)、在土壤中分布范圍更大，這樣有利于吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而有利于錦雞兒植株的生長(zhǎng)。兩個(gè)供試菌株之間相比較，它們對(duì)錦雞兒生長(zhǎng)的影響作用有差異。如I號(hào)菌株與錦雞兒根系形成的根瘤比II號(hào)菌株形成的根瘤大；接種II號(hào)菌株植物的平均單株結(jié)瘤數(shù)比接種I號(hào)菌株的多；接種II號(hào)菌株植株的株高、根系長(zhǎng)度、生物量大于接種I號(hào)菌株的植株。用分子生物學(xué)鑒定結(jié)果是：I號(hào)菌株屬于根瘤菌屬（Rhizbobium）、II號(hào)菌株屬于中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）（未發(fā)表），這說明不同種屬的根瘤菌對(duì)錦雞兒植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不同。關(guān)于接種根瘤菌對(duì)苜蓿、大豆、花生等草本豆科植物的研究和應(yīng)用很多，對(duì)木本豆科植物這方面的研究相對(duì)較少[18-21]。下一步我們將分析接種不同根瘤菌菌株對(duì)錦雞兒植株的蛋白質(zhì)、葉綠素、纖維素等含量的影響，綜合評(píng)價(jià)接種不同根瘤菌菌株對(duì)錦雞兒植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，為錦雞兒根瘤菌菌劑的研發(fā)和實(shí)施提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]牛西午.中國(guó)錦雞兒屬植物資源研究-分布及分種描述[J].西北植物學(xué)報(bào)，1999，19（5）：107-133.

[2]周道瑋，劉鐘齡，馬毓泉.豆科錦雞兒屬（CaraganaFabr.）植物地理分布與分化研究[J].植物研究，2005，25（4）：471-487.

[3]張媛媛，馬成倉(cāng)，韓磊，等.內(nèi)蒙古高原荒漠區(qū)四種錦雞兒屬植物灌叢沙包形態(tài)和固沙能力比較[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，11：3343-3351.

[4]李香真，張淑敏，邢雪榮.小葉錦雞兒灌叢引起的植物生物量和土壤化學(xué)元素含量的空間變異[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2002，1（7）：24-30.

[5]賈麗，曲式曾.豆科錦雞兒屬植物研究進(jìn)展[J].植物研究，2001，21（4）：515-518.

[6]潘蘭，賈新岳，石明輝，等.新疆產(chǎn)四種錦雞兒的民族植物學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（7）：578-579.

[7]陳文峰，陳文新.我國(guó)豆科植物根瘤菌資源多樣性及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[J].生物學(xué)通報(bào)，2003，38（7）：1-4.

[8]史曉霞，師尚禮，楊晶，等.豆科植物根瘤菌分類研究進(jìn)展[J].草原與草坪，2006，1（114）：12-17.

[9]李喬仙，張斌，戴燕燕，等.南苜蓿根瘤菌生理生化特性研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（22）：10365-10369.

[10]趙葉舟，王浩銘，汪自強(qiáng).豆科植物和根瘤菌在生態(tài)環(huán)境中的地位和作用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展，2013，30（4）：7-12.

[11]張紅娟，張朝陽，強(qiáng)磊.檸條錦雞兒根瘤菌及其共生固氮基因多樣性[J].西北植物學(xué)報(bào)，2014，23（10）：194-199.

[12]KucukC，KivanM，KnaciE.CharacterizationofRhizobiumsp.isolatedfrombean[J].TurkJbio，L2006，30：127-132.

[13]陳文新.土壤中影響根瘤菌存活的主要因素[J].土壤學(xué)進(jìn)展，1986，5：179-184.

[14]HashemFM，SwelimDM，KuykendallLD.Identificationandcharacterizationofsaltandthermo-tolerantLeucaenanodulatingRhizobiumstrains[J].BiolfertilSoils，1998，27：335-341.

[15]HerreraMA，SalamancaCP，BareaJ.InoculationofwoodylegumeswithselectedarbuscularmycorrhizalfungiandrhizobiatorecocerdeseritifiedMediterraneanecosystems[J].ApplEnvironMicrobio，1993，56（1）：129-133.

[16]王衛(wèi)衛(wèi)，關(guān)桂蘭，李仲元.新疆根瘤菌抗逆性研究[J].干旱區(qū)研究，1989，4：9-18.

[17]關(guān)桂蘭，郭沛新，王衛(wèi)衛(wèi)，等.新疆干旱地區(qū)根瘤菌資源研究Ⅱ.根瘤菌抗逆性及生理生化反應(yīng)特性[J].微生物學(xué)報(bào)，1992，05：346-352.

[18]周利平，劉文杰，馬煥成，等.根瘤菌菌株和接種根瘤菌植株的耐旱性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11978-11980+11983.

[19]劉曉云，郭振國(guó)，楊亞男，等.地木耳提取液及根瘤菌對(duì)小葉錦雞兒幼苗生長(zhǎng)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2011，28（4）：572-576.

[20]石茂玲，鄧波，劉忠寬，等.5株根瘤菌接種紫花苜蓿的效果[J].草業(yè)科學(xué)，2015，32（1）：101-106.

[21]鐘增濤，沈其榮，冉煒，等.旱作水稻與花生混作體系中接種根瘤菌對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（3）：303-308.

作者簡(jiǎn)介：王宇（1989-），男，遼寧省鞍山市人，碩士研究生，主要從事土壤微生物方面的研究。