張慧君　陳勁楓

摘要：植物形態(tài)發(fā)生變化時，生理生化特性研究是揭開這一現(xiàn)象的一個重要方面，很多研究已經(jīng)證實，形態(tài)建成的前提是植物生理生化的改變，其生理生化差異導致了不同的形態(tài)發(fā)生，植物不定芽形成是一個很復雜的現(xiàn)象。本研究就植物組織培養(yǎng)過程中生理生化變化的幾個方面加以討論。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；生理生化；生理機制；形態(tài)；不定芽；內(nèi)源激素

中圖分類號：Q943.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0033-03

作為植物細胞全能性的一種表達方式，體細胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點，并在很多領(lǐng)域中廣泛應用。人們對植物不定芽再生的機理及其應用方面做了大量的研究，在不同離體組織培養(yǎng)的養(yǎng)分需求，不同植物對環(huán)境因素、培養(yǎng)基成分、添加物質(zhì)、植物激素的種類和濃度等各因素的需求，不同材料的不定芽增生和生長及不定芽發(fā)育機理等方面都得到了很大發(fā)展。本研究從植物再生過程中的生理生化角度進行綜述，幫助大家了解有關(guān)進展。

1 植物體細胞胚胎發(fā)生過程中的細胞生物學研究

細胞生物學研究體細胞胚發(fā)生過程是了解體胚發(fā)生過程的重要研究方法，主要通過石蠟切片技術(shù)、超微切片技術(shù)和組織化學染色研究方法探討體細胞胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學建成，觀察體細胞胚的發(fā)育過程，其中石蠟切片法最常見。目前關(guān)于植物體細胞胚胎發(fā)生過程的報道越來越多，普遍認為體細胞胚胎發(fā)生經(jīng)歷球形胚或原胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚4個階段，但對體細胞胚胎發(fā)生的起源研究結(jié)果不盡一致，既有關(guān)于單細胞的報道，也有關(guān)于多細胞起源的報道。對植物體細胞胚胎發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果普遍顯示，在非胚性向胚性細胞的轉(zhuǎn)化過程中，胚性細胞形成厚壁，具有胞質(zhì)濃、核大、液泡小、核仁大、細胞器豐富、線粒體數(shù)量增多、胞間連絲廣泛存在等特點。孫麗芳對玉米愈傷組織用石蠟切片組織觀察及電鏡掃描，結(jié)果顯示，胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織在細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、愈傷組織外部形態(tài)和分化能力方面具有明顯差異，為以后研究奠定理論依據(jù)[1]。江榮翠對滇秋木體細胞采用掃描電鏡進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織具有明顯的形態(tài)特征[2]；張濤對蕓芥研究表明，能產(chǎn)生體細胞胚的胚性細胞具有核大、質(zhì)濃、染色深、細胞排列緊密等特點，跟周圍的細胞有明顯的界限[3]。

2 抗氧化酶類

酶是植物生化反應的催化劑，在胚狀體發(fā)生過程中起非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所有需氧生物都必須依賴氧才能獲得能量和維持生命，然而當活性氧濃度超過正常水平時，對生物細胞會產(chǎn)生毒害作用[4-8]。有研究報道，生物體為了減輕和防止活性氧損傷，已形成了復雜的氧化反應機制，在植物組織培養(yǎng)的不同階段，這種抗氧化反應也是不斷變化的[9-14]。近年來，已有很多關(guān)于植物離體培養(yǎng)的研究，結(jié)果表明不定根、愈傷組織、不定芽等的形態(tài)發(fā)生都與過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性有關(guān)[15]。王亞馥等指出，在枸杞離體培養(yǎng)過程中，POD活性逐漸增強，整個變化過程中出現(xiàn)2個峰值，分別在分生細胞團芽的形成階段[16]。莊東紅等的研究結(jié)果表明，在組織培養(yǎng)過程中，大白菜子葉POD活性變化隨著外植體的分化、不定芽的產(chǎn)生呈增強趨勢[17]。崔凱榮等在研究枸杞體細胞胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，隨著體細胞的發(fā)育，SOD、POD、CAT相互配合來調(diào)節(jié)胚性細胞的生長分化，這3種酶在枸杞胚胎發(fā)生與發(fā)育過程中都有不同的變化，變化情況與體細胞的伸長密切相關(guān)[18]。還有研究認為，體細胞胚發(fā)生與發(fā)育是大量酶特異性合成及參與代謝的結(jié)果，在細胞發(fā)育中可以穿透細胞膜，可以減少對細胞的損害，體細胞胚胎的發(fā)育與超氧化物自由基的清除密切相關(guān)[19-21]。許多植物的過氧化物酶活性在體胚發(fā)生過程中較強，詹園鳳等在大蒜體細胞胚胎發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD、CAT活性變化與胚性愈傷組織的誘導及體胚的發(fā)育密切相關(guān)，POD對體胚的誘導起主導作用，而SOD和CAT在體胚的發(fā)育和成熟中起主導作用[22]。

3 生化物質(zhì)的變化

在體細胞胚胎發(fā)生過程中，可溶性糖含量的變化可能為細胞分裂和發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎，并可能預示著新的發(fā)育狀態(tài)即將開始。陳陸琴等將金蓮花、合歡莖尖接入分化培養(yǎng)基上后發(fā)現(xiàn)，莖尖基部形成愈傷組織，而后愈傷組織分化出不定芽，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前12 d，可溶性糖含量迅速增加，伴隨著不定芽的生長，可溶性糖含量開始緩慢減少[23]。從啟動愈傷組織開始到形成愈傷組織過程中，可溶性糖含量較低；而從愈傷組織形成開始階段到愈傷組織分化形成不定芽的階段，可溶性糖含量較高，這可能是由于可溶性糖為形成不定芽的碳骨架原料，其含量提高可以保證愈傷組織的原料供應。當愈傷組織進行不定芽分化時，由于不定芽原基形成、生長，可溶性糖含量增多，直到器官分化完成后才開始逐漸減少，這也說明可溶性糖在不定芽發(fā)生過程中起的主要作用之一是提供碳源[24]。詹園鳳等在對大蒜體細胞胚胎發(fā)生過程進行研究時發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量在其細胞脫分化早期出現(xiàn)1次高峰，隨后迅速下降，在成熟期略有回升，由此得出可溶性糖在細胞脫分化早期出現(xiàn)累積高峰，細胞進入迅速分裂階段，此時可能為細胞進一步發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎；可溶性糖含量在胚成熟期升高，這可能為新的發(fā)育階段提供物質(zhì)和能量[22]。

辛偉杰發(fā)現(xiàn)，花燭體胚發(fā)生過程中可溶性蛋白質(zhì)含量在球形胚和成熟胚2個時期出現(xiàn)峰值，而從誘導外植體形成胚性愈傷組織時，蛋白質(zhì)含量降低；脫分化時，外植體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解轉(zhuǎn)化成糖類及其他物質(zhì)，為胚性細胞的形成提供能量，隨著胚性細胞進一步發(fā)育，細胞內(nèi)積累了大量的蛋白質(zhì)；成熟胚時期，可溶性蛋白質(zhì)又大量積累，為后期的體胚萌發(fā)提供了物質(zhì)保證[25]。齊力旺等發(fā)現(xiàn)，落葉松胚性愈傷組織中的游離氨基酸含量明顯低于非胚性愈傷組織，特別是游離基酸中的精氨酸含量，非胚性愈傷組織中精氨酸為胚性愈傷組織的 4 倍[26]。有報道指出，多胺能促進體細胞胚發(fā)生，而精氨酸為多胺合成的前體，其含量變化可能與多胺的合成及體細胞胚發(fā)生關(guān)系密切。

植物形態(tài)發(fā)生實質(zhì)上受基因相互調(diào)控，是基因之間按時空順序表達的結(jié)果[27]。王亞馥等研究發(fā)現(xiàn)，在枸杞愈傷組織再分化形成不定芽時，上升的可溶性蛋白質(zhì)含量為枸杞形態(tài)發(fā)生提供了必需的物質(zhì)基礎[16]。已有大量研究結(jié)果表明，在植物體細胞胚胎發(fā)生過程中，可溶性蛋白質(zhì)組分和含量發(fā)生改變，盡管有些結(jié)果不是很一致，但總的變化趨勢是相同的。不同物種中胚性愈傷組織的可溶性蛋白質(zhì)合成速率和含量遠高于非胚性愈傷組織，可見前者代謝活性高于后者。

4 體胚發(fā)生中的特異蛋白

蛋白質(zhì)是基因調(diào)控和表達的產(chǎn)物，植物體細胞胚胎發(fā)生是植物相關(guān)基因按一定時空表達順序而產(chǎn)生的結(jié)果。在體細胞胚胎發(fā)育的過程中，從外形、生理上可以分為幾個階段，即原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚、成熟胚以及再生成苗階段，植物離體再生中各個時期都必然會存在特異蛋白的表達。Marsoni 等成功地比較了葡萄胚性發(fā)生過程中形成的非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織蛋白表達差異，發(fā)現(xiàn)共有35 個蛋白點差異表達，且這些蛋白點可能與胚性發(fā)生有關(guān)[28]。這些蛋白既可作為調(diào)控因子，又可作為結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和貯藏蛋白。孫麗芳利用蛋白質(zhì)組技術(shù)檢測了玉米胚性發(fā)生相關(guān)蛋白的表達情況，共有 42 個蛋白點發(fā)生顯著變化，質(zhì)譜成功鑒定 29 個蛋白點，根據(jù)蛋白功能將其分為細胞繁殖、翻譯與蛋白合成、脅迫響應、信號轉(zhuǎn)導等，因此對體細胞胚胎發(fā)生過程中特異蛋白的分析，對優(yōu)化體胚發(fā)生機制、調(diào)控體細胞胚胎發(fā)生和體胚發(fā)生、發(fā)育的相關(guān)基因克隆與研究、遺傳轉(zhuǎn)化等工作具有重大意義[1]。

5 內(nèi)源激素水平的變化

植物激素是植物體內(nèi)天然存在的一系列有機化合物，作為執(zhí)行細胞通信功能的化學信息，在代謝、生長、形態(tài)建成等植物生理活動的各個方面均起十分重要的體內(nèi)信號傳導作用；植物體胚發(fā)生過程中的生理效應往往是多種激素間相互作用的結(jié)果，體胚發(fā)育時期不同，內(nèi)源激素發(fā)生的變化不同。植物內(nèi)源激素含量調(diào)控細胞分化和生長的方向與進程，以致于植物生命活動的整個過程，不同的植物種類和外植體都影響著內(nèi)源因素的變化[29-30]。一些研究結(jié)果表明，植物愈傷組織的分化是內(nèi)源生長素含量逐步降低的結(jié)果，也是細胞分裂素含量逐步升高的過程。劉滌等在研究煙草離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，與未分化出芽的愈傷組織相比，已分化出芽的愈傷組織內(nèi)源生長素含量明顯升高[31]；王秀紅等研究發(fā)現(xiàn)，在NAA和 6-BA 等2種激素作用下，水稻花藥、幼胚和花穗都可以誘導愈傷組織完成芽的形態(tài)分化，在內(nèi)源NAA含量增高時，其愈傷出苗率逐漸下降，降低時愈傷出苗率逐漸增高，與內(nèi)源細胞分裂素剛好相反，然而外源植物激素必須通過對內(nèi)源激素平衡的調(diào)節(jié)才發(fā)生作用[32-33]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在NAA和6-BA作用下可以誘導水稻花藥、幼胚和花穗來源的愈傷組織完成芽的形態(tài)分化，其愈傷出苗率與內(nèi)源生長素存在負效應，而與內(nèi)源細胞分裂素存在正效應[34-35]。植株生長發(fā)育過程與植株內(nèi)源和外源激素的種類、含量及配比等有密切的關(guān)系[36-38]；裴東等的研究結(jié)果表明，內(nèi)源激素對菊花、水稻愈傷、紅富士蘋果、南瓜不定芽形成和分化起重要作用[39-41]；林士杰等在研究整個不定芽形成的過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源激素ABA對不定芽的形成有利[42]；芽原基的啟動分化階段與較高濃度的ABA相伴隨，芽原基生長發(fā)育階段與高濃度的ABA相關(guān)，各種內(nèi)源激素的代謝和動態(tài)平衡在細胞分化中起重要且關(guān)鍵的作用。

在植物體內(nèi)，內(nèi)部條件和外部培養(yǎng)條件相互作用，結(jié)果導致植物體內(nèi)器官發(fā)生形態(tài)變化，內(nèi)源激素的調(diào)控是重要因素之一，植物的外源激素須通過對內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)來控制器官的生長發(fā)育，各種植物生長物質(zhì)的水平都通過影響植物外植體的基因表達而引起器官分化的。內(nèi)源激素與受體或載體結(jié)合通過不同的信號轉(zhuǎn)導和傳遞方式來控制不同的生理功能，但其激素在分子水平上通過何種途徑來調(diào)控植物再生的作用機制仍有待深入研究。

6 問題與展望

總之，在植物組織培養(yǎng)過程中，植株再生途徑包括胚狀體發(fā)生，器官發(fā)生和體細胞發(fā)生，不同植物和同一植物不同組織或器官的再生途徑也不同，且植株再生受外植體生理狀態(tài)至關(guān)重要的影響，這些生理機制仍有待于進一步研究。這些變化是多方面的，由生理變化到內(nèi)部基因的改變，都是相互作用的結(jié)果，這些隨著研究的不斷深入，分子生物學的蓬勃發(fā)展，這一科學問題必將會解決，植物再生的生理機制將在植物工廠化、 規(guī)?；a(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

參考文獻：

[1]孫麗芳. 王米胚性組織相關(guān)克隆與功能驗證[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2012.[HJ1.2mm]

[2]江榮翠. 滇秋木體細胞胚胎發(fā)生及其機理研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2010.

[3]張 濤. 蕓芥體細胞胚胎發(fā)生的組織細胞學研究[J]. 園藝學報，2007，34（1）：131-134.

[4]許煜泉，史益敏，尹協(xié)芬. 番茄離體子葉培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生及過氧化物酶的動態(tài)[J]. 上海農(nóng)學院學報，1992，10（2）：121-126.

[5]張靜蘭，唐定臺，徐桂芳，等. 放線菌素D和環(huán)己亞胺對激素誘導綠豆子葉脫分化及其核酸、蛋白質(zhì)代謝的作用[J]. 植物學報，1982，24（5）：433-439.

[6]戴均貴，周吉源. 華黃芪離體形態(tài)發(fā)生過程中生理生化特性變化的研究[J]. 華中師范大學學報：自然科學版，1997，31（2）：220-224 .

[7]屈姝存，劉選明，周樸華，等. 百合鱗片細胞形態(tài)發(fā)生中生理生化特性研究[J]. 生命科學研究，1998，2（4）：288-294.

[8] Meratan A A，Ghaffari S M，Niknam V. In vitro organogenesisand antioxidant enzymes activity in Acanthophyllum sordidum[J]. Biol Plant，2009，53：5-10.

[9]Batkova P，Pospisilova J，Synkova H. Production of reactive oxygen species and development of antioxidative systems during in vitro growth and ex vitro transfer[J]. Biologia Plantarum，2008，52（3）：413-422.

[10]Cui K R，Xing G S，Liu X M，et al. Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbarum L.[J]. Plant Science，1999，146（1）：9-16.

[11]van Breusegem F，Vranová E，Dat J F，et al. The role of active oxygen species in plant signal transduction[J]. Plant Science，2001，161（3）：405-414.

[12]Papadakis A K，Siminis C I，Roubelakis-Angelakis K A. Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts[J]. Plant Physiology，2001，126（1）：434-444.

[13]Tian M，Gu Q，Zhu M Y. The involvement of hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus [J]. Plant Sci，2003，165（4）：701-707.

[14]Zhang S G，Han S Y，Wen H Y，et al. Changes in H2O2 content and antioxidant enzyme gene expression during the somatic embryo genesis of Larix leptolepis[J]. Plant Cell Tiss Org，2010，100：21-29.

[15]Abbasi B H，Khan M，Guo B，et al. Efficient regeneration and antioxidative enzyme activities in Brassica rapa var. turnip[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，105（3）：337-344.

[16]王亞馥，王侖山，丁惠賓. 枸杞組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的細胞組織學觀察[J]. 蘭州大學學報，1989，25（4）：88-92.

[17]莊東紅，杜 虹. 大白菜子葉培養(yǎng)過程中POD同工酶和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化[J]. 汕頭大學學報：自然科學版，2002，17（1）：64-68，73.

[18]崔凱榮，任紅旭，邢更妹，等. 枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J]. 蘭州大學學報：自然科學版，1998，34（3）：93-99.

[19]Zhang B，Wang H Q，Wang P，et al. Involvement of nitric oxide synthase-dependent nitricoxide and exogenous nitric oxide in alleviating NaCl induced osmotic and oxidative stress in Arabidopsis thaliana[J]. Afr J Agr Res，2010，5（13）：1713-1721.

[20]Srivastav M，Kishor A，Dahuja A，et al. Effect of paclobutrazol and salinity on ion leakage，proline content and activities of antioxidant enzymes in mango（Mangifera indica L.）[J]. Sci Hortic，2010，125（4）：785-788.

[21]Zhao Y E. Cadmium accumulation and antioxidative defenses in leaves of Triticum aestivum L. and Zea mays L.[J]. African Journal of Biotechnology，2011，10（15）：2936-2943.

[22]詹園鳳，吳 震，金瀟瀟，等. 大蒜體細胞胚胎發(fā)生過程中抗氧化酶活性變化及某些生理特征[J]. 西北植物學報，2006，26（9）：1799-1802.

[23]陳陸琴，王關(guān)林，李洪艷，等. 彩萼石楠的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學通訊，2005，41（1）：58.

[24] 張良波. 屋頂長生草離體培養(yǎng)及其形態(tài)發(fā)生的細胞學與生理生化變化的研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2004.

[25]辛偉杰. 花燭體細胞胚胎發(fā)生及相關(guān)生理生化研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2006：42-46.

[26]齊力旺，李 玲，韓一凡，等. 落葉松不同類型胚性和非胚性愈傷組織的生理生化差異[J]. 林業(yè)科學，2001，37（3）：20-29.

[27]Pan Z Y，Zhu S P，Guan R，et al. Identification of 2，4-D-responsive proteins in embryogenic callus of Valencia sweet orange （Citrus sinensis Osbeck） following osmotic stress[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，103（2）：145-153.

[28]Marsoni M，Bracale M，Espen L，et al. Proteomic analysis of somatic embryogenesis in Vitis vinifera[J]. Plant Cell Reports，2008，27（2）：347-356.

[29]Ali A，Ahmad T，Abbasi N A，et al. Effect of different concentrations of auxins on in vitro rooting of olive cultivar ‘Moraiolo[J]. Pakistan Journal of Botany，2009，41（3）：1223-1231.

[30]Feng J C，Yu X M，Shang X L，et al. Factors influencing efficiency of shoot regeneration in Ziziphus jujuba Mill.‘Huizao[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，101（1）：111-117.

[31]劉 滌，遲靜芬，劉桂蕓. 煙草愈傷組織器官發(fā)生過程中外源激素的作用[J]. 植物生理學報，1986，12（1）：104-108.

[32]王秀紅. 水稻不同外植體的組織培養(yǎng)能力及其內(nèi)源激素分析[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2002.

[33]Leshem B. Polarity and responsive regions for regeneration in the cultured melon cotyledon[J]. Journal of Plant Physiology，1989，135（2）：237-239.

[34]Aida M，Ishida T，F(xiàn)ukaki H，et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell，1997，9（6）：841-857.

[35]Aida M，Ishida T，Tasaka M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis：interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes[J]. Development，1999，126（8）：1563-1570.

[36]Centeno M L，Rodriguez A，F(xiàn)eito I，et al. Relationship between endogenous auxin and cytokinin levels and morphogenic responses in Actinidia deliciosa tissue cultures[J]. Plant Cell Reports，1996，16（1/2）：58-62.

[37]Valdés A E，Ordás R J，F(xiàn)ernández B，et al. Relationships between hormonal contents and the organogenic response in Pinus pinea cotyledons[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2001，39（5）：377-384.

[38]Wang X H，Shi X Y，Wu X J，et al. The influence of endogenous hormones on culture capability of different explants in rice[J]. Agric Sci China，2005，4（5）：343-347.

[39]裴 東，鄭均寶，凌艷榮，等. 紅富士蘋果試管培養(yǎng)中器官分化及其部分生理指標的研究[J]. 園藝學報，1997，24（3）：229-234.

[40]邵繼平. 聲波刺激對菊花愈傷組織內(nèi)源激素IAA和ABA動態(tài)變化的實驗研究[D]. 重慶：重慶大學，2003.

[41]田春英，邵建柱，劉 瑩，等. 紅富士蘋果葉片不定芽再生中激素、多胺和NO含量的變化[J]. 園藝學報，2010，37（9）：1403-1408.

[42]林士杰，姜 靜，馮 昕，等. 黑林1號楊組培葉片不定根的發(fā)生與內(nèi)、外源激素關(guān)系的研究[J]. 林業(yè)科技，2006，31（1）：8-11.