趙小華 何麗清 蓋江華

摘要：目的 采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)定小青龍湯證大鼠血液中內(nèi)源性代謝物，為小青龍湯證本質(zhì)研究提供依據(jù)。方法 將36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只、模型組13只和小青龍湯組13只，模型組和小青龍湯組制作外寒內(nèi)飲（小青龍湯證）模型，小青龍湯組灌胃小青龍湯，空白對(duì)照組不作任何處理。 15 d后，3組大鼠腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。圖譜經(jīng)預(yù)處理后采用偏最小二乘法-判別分析進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)13種小分子標(biāo)志物，分別為乳酸、3-羥基丁酸、甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸、葡萄糖、花生四烯酸等代謝物質(zhì)。結(jié)論 乳酸、甘氨酸等標(biāo)記物集中表現(xiàn)為能量代謝、免疫功能和炎癥反應(yīng)，為小青龍湯證本質(zhì)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：氣相色譜-質(zhì)譜；血液；小青龍湯證；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.023

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0083-04

Metabonomics Study on Blood of Rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome Based on GC-MS ZHAO Xiao-hua1， HE Li-qing1， GAI Jiang-hua2 （1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China；2.Changzhi Chinese Medicine Hospital， Changzhi 046000， China）

Abstract：Objective To determine the endogenous metabolites in blood of rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome by using GC-MS；To provide evidence for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome. Methods Totally 36 male Wistar rats were randomly divided into blank control group （10 rats）， model group （13 rats）， and Xiaoqinglong Decoction group （13 rats）. Model group and Xiaoqinglong Decoction group were used to make the models of exogenous cold and internal fluid syndrome （Xiaoqinglong Decoction Syndrome）. Rats in Xiaoqinglong Decoction group received gavage with Xiaoqinglong Decoction， while rats in blank control group received nothing. Blood of rats in the three groups was taken from the abdominal aorta and detected by GC-MS 15 days later， and analyzed by multivariate statistical analysis with PLS-DA. Results 13 kinds of biomarkers were found：lactic acid， 3-hydroxy-butyric acid， glycine， serine， lysine， dextrose， arachidonic acid and other metabolites. Conclusion Expressions of biomarkers， such as lactic acid and glycine， are energy metabolism， immune function， and inflammation， which provide material basis for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome.

Key words：GC-MS；blood；Xiaoqinglong Decoction Syndrome；rats

小青龍湯首見(jiàn)于《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之”。全方共8味藥，是張仲景治療外寒內(nèi)飲證的名方。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81102538）；山西中醫(yī)學(xué)院臨床基礎(chǔ)項(xiàng)目（2011JC05）

通訊作者：何麗清，E-mail：hlqyx@163.com

小青龍湯證為外感風(fēng)寒表邪、內(nèi)有水飲之氣、內(nèi)外合邪而表現(xiàn)出的適合服用小青龍湯的癥狀，其臨床表現(xiàn)較多，其中咳嗽、痰多、喘息為小青龍湯證辨證關(guān)鍵。盡管對(duì)小青龍湯已有較多研究，但對(duì)其證本質(zhì)研究仍有不足。目前，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)較為成熟地運(yùn)用于中醫(yī)證候客觀化研究，且在證候動(dòng)物模型證本質(zhì)研究中取得一定進(jìn)展，代謝組學(xué)與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密[1-2]。本研究采用GC-MS測(cè)定大鼠血液中內(nèi)源性代謝物，為小青龍證證本質(zhì)研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace GC-PolarisQ Mass， Thermo Finnigan），DZF-1B型真空干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療醫(yī)械廠），TGL-6高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司），KQ2200型數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），ESJ120-4電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司）。

N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺[MSTFA，含1%TMCS（三甲基氯硅烷）]，美國(guó)Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺鹽酸鹽、正庚烷、乙腈均為分析純，北京化工試劑公司；二十四烷，上海索萊寶生物科技有限公司。

內(nèi)標(biāo)液：精密稱取1 mg二十四烷，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得0.1 mg/mL二十四烷內(nèi)標(biāo)工作液。

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±10）g，清潔級(jí)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)SCXK（京）2009-2004。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與取樣

將36只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只、模型組13只和小青龍湯組13只，飼養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物房。依據(jù)外感風(fēng)寒表邪、內(nèi)有水飲之氣，內(nèi)外合邪病機(jī)制作外寒內(nèi)飲（小青龍湯證）模型：將模型組和小青龍湯組大鼠放置于寒冷環(huán)境（控制室內(nèi)溫度在10 ℃左右）中喂養(yǎng)，每日在低溫環(huán)境[（0±4）℃]冷凍1 h，并放入冰水中游泳，水面淹沒(méi)大鼠鼻尖時(shí)將大鼠撈出，持續(xù)4周，同時(shí)進(jìn)寒涼飲食（冷凍飼料及冰水）?？瞻讓?duì)照組不做任何處理。小青龍湯組大鼠給予小青龍湯（麻黃9 g，白芍9 g，細(xì)辛3 g，干姜3 g，炙甘草9 g，桂枝9 g，五味子9 g，姜半夏9 g，山西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥房提供）灌胃，連續(xù)15 d。將3組大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，存放在-80 ℃冰箱中[4]。

2.2 生物樣品制備

從-80 ℃冰箱中取出血液，解凍，搖勻，取上清液100 ?L，加入250 ?L乙腈，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液150 ?L，氮?dú)獯蹈?，加?0 ?L甲氧胺（15 mg/mL）吡啶溶液，70 ℃反應(yīng)1 h。加入50 ?L MSTFA，40 ℃反應(yīng)90 min。加入500 ?L正庚烷（0.1 mg/mL二十四烷），渦旋1 min，進(jìn)行GC-MS分析。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

進(jìn)樣量：1 ?L；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；離子源溫度：200 ℃；載氣：氦氣；載氣流速：1 mL/min；DB-5MS毛細(xì)管柱；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜檢測(cè)條件：電離方式EI，電子能量70 eV，全掃描模式，50～650 m/z。程序升溫：起始溫度60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升至140 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，保持6 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。

2.4 模式識(shí)別分析與統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SIMCA-P+軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和建立模型，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)截荷圖遠(yuǎn)端標(biāo)記物進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血液樣品測(cè)定結(jié)果

3組血液樣品GC-MS測(cè)定所得色譜圖見(jiàn)圖1。各色譜峰分布均勻，峰形較好，且得到很好的分離，模型組和空白對(duì)照組直觀可見(jiàn)較多差異峰，如15.11、15.80、27.67、33.17、41.25。說(shuō)明大鼠造模后體內(nèi)代謝物發(fā)生了明顯變化。

3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

分別對(duì)空白對(duì)照組與模型組、小青龍組與空白對(duì)照組血液樣本GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，PLS-DA分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

從散點(diǎn)圖可以看出，空白對(duì)照、模型組分布在t[1]軸兩側(cè)，直觀反映了空白對(duì)照組與模型組之間有差別，說(shuō)明造模之后機(jī)體的代謝物發(fā)生了變化。小青龍湯組接近空白對(duì)照組，反映了模型大鼠在服用小青龍湯之后，代謝物明顯接近空白對(duì)照組。結(jié)合載荷圖、典型的血液圖譜及SPSS軟件分析結(jié)果得到這些生物標(biāo)志物：乳酸、甘氨酸、丁二酸、絲氨酸、賴氨酸、纈氨酸、吡喃半乳糖苷、山梨醇、葡萄糖、花生四烯酸等。以上這些代謝物在用藥后發(fā)生明顯變化。

從3組載荷圖結(jié)合VIP值（variable importance in the projection，變量重要性投影，可以預(yù)測(cè)各個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)模型的貢獻(xiàn)值，VIP>1的意義在于可能為潛在標(biāo)志物）尋找導(dǎo)致其分開(kāi)的差異性成分，即小分子標(biāo)志物，結(jié)果共找到13個(gè)標(biāo)志物，見(jiàn)表1。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)13個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行t檢驗(yàn)，部分結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

由于GC-MS在具有諸多優(yōu)點(diǎn)同時(shí)，也有不能分析大分子、難揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的缺點(diǎn)，所以，在處理血液樣本同時(shí)需要對(duì)樣本進(jìn)行衍生化處理。三甲基硅烷（TMS）衍生化在樣本硅烷化處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，結(jié)合PLS-DA有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，能夠?qū)颖具M(jìn)行較好的分析，有利于尋找內(nèi)源性代謝物的小分子標(biāo)記物。所以參考文獻(xiàn)[5-7]，本試驗(yàn)選擇TMS衍生化試劑對(duì)血樣進(jìn)行處理。

血液中的主要代謝產(chǎn)物為氨基酸類、脂肪酸類、有機(jī)酸類等，且與機(jī)體內(nèi)多種代謝途徑密切相關(guān)。在機(jī)體內(nèi)，任何疾病的發(fā)生都會(huì)引起其內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生變化。本研究采用GC-MS技術(shù)分析血液中發(fā)生顯著變化的代謝物，說(shuō)明引起小青龍湯證整體代謝變化的情況，尋找小分子標(biāo)記物，進(jìn)一步探討小青龍湯證證本質(zhì)。

其中乳酸在模型組中大量堆積（較空白對(duì)照組顯著升高，P<0.01，見(jiàn)表2），造成酸痛、倦怠、發(fā)冷、疼痛等。說(shuō)明模型組機(jī)體出現(xiàn)能量代謝異常，解釋了模型組中動(dòng)物在寒邪上受首先犯肺而出現(xiàn)的機(jī)體應(yīng)激發(fā)應(yīng)。尿素是了解腎臟機(jī)能的重要指標(biāo)，在模型組的血液中尿素升高，說(shuō)明機(jī)體內(nèi)有毒的含氮代謝物增加，又由于尿素在蛋白質(zhì)和氨基酸分解過(guò)程中，其升高進(jìn)一步說(shuō)明模型組的代謝異常，解釋了模型組中動(dòng)物由于水液代謝障礙，出現(xiàn)的尿量減少、水腫癥狀。葡萄糖、吡喃半乳糖苷較空白對(duì)照組下降，3-羥基丁酸較空白對(duì)照組升高，均說(shuō)明模型組能量代謝異常。絲氨酸、賴氨酸均能提高機(jī)體免疫力的氨基酸，模型組較空白對(duì)照組顯著下降，說(shuō)明模型組機(jī)體的免疫力下降，機(jī)體在感受寒邪后，正氣抗邪于外，能量代謝增加，而表現(xiàn)出倦怠等。另外，血液中的花生四烯酸是白三烯的前體，白三烯與支氣管哮喘、慢性支氣管炎的炎癥有密切關(guān)系[8-10]。模型組中花生四烯酸明顯升高（與空白對(duì)照組比較，P<0.05，見(jiàn)表2），說(shuō)明機(jī)體內(nèi)有明顯炎癥，小青龍湯組較空白對(duì)照組標(biāo)記物均有不同程度的回調(diào)，說(shuō)明小青龍湯證與炎癥、免疫相關(guān)。

核磁共振技術(shù)與GC-MS技術(shù)同屬于代謝組學(xué)研究中的兩大技術(shù)。本課題組前期研究中，基于核磁共振技術(shù)檢測(cè)到了肌酸、乳酸、3-羥基丁酸、天冬氨酸、?；撬岬仁畮追N代謝物，數(shù)目較少，這與其靈敏度較低、分辨率不高的缺點(diǎn)有關(guān)。相對(duì)于核磁共振技術(shù)，GC-MS技術(shù)檢測(cè)到了乳酸、3-羥基丁酸、甘氨酸等30多種代謝物，源于其高靈敏度、高分辨率、高通量等優(yōu)勢(shì)。單純氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸等8種。

前期研究中，基于核磁共振技術(shù)檢測(cè)血液找到的小分子標(biāo)志物反映小青龍湯證主要與能量代謝、免疫功能、機(jī)體應(yīng)激方面有關(guān)[4]。本次基于GC-MS的研究結(jié)果，即小青龍湯證證本質(zhì)與能量代謝、炎癥反應(yīng)、免疫相關(guān)，與前期結(jié)果較為一致。另外，本研究在血液檢測(cè)中找到了與炎癥相關(guān)的標(biāo)記物花生四烯酸，與免疫功能相關(guān)的絲氨酸、酪氨酸，與能量代謝相關(guān)的葡萄糖、吡喃葡萄糖等代謝物，更加說(shuō)明了小青龍湯證的本質(zhì)所在。

本研究結(jié)果從另外一方面對(duì)整體代謝上小青龍湯證證本質(zhì)進(jìn)行了剖析與探究。為了更好地應(yīng)用GC-MS這一檢測(cè)手段，綜合分析小青龍湯證，找出其本質(zhì)的小分子標(biāo)記物，我們將繼續(xù)用以分析肝、腎、肺組織，并動(dòng)態(tài)分析尿液，以更加全面闡釋小青龍湯證。

本研究驗(yàn)證了GC-MS技術(shù)這一高通量、高靈敏的分析手段結(jié)合PLS-DA模式識(shí)別用于證本質(zhì)研究的可行性，基于機(jī)體整體功能性變化檢測(cè)方法與中醫(yī)的整體理論相結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)源性差異代謝物，研究機(jī)體代謝途徑，用以區(qū)分疾病模型和正常個(gè)體，建立疾病經(jīng)典指標(biāo)與代謝組學(xué)中生物標(biāo)志物的關(guān)系，從而為證候本質(zhì)研究提供依據(jù)。

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（收稿日期：2014-06-29；編輯：陳靜）