傅大莉等

摘要：目的 研究冰片對皮膚活性表皮作用方式，探究冰片作為經(jīng)皮促透劑的促透作用機制。方法 選擇常用經(jīng)典化學經(jīng)皮促透劑氮酮作為陽性對照促透劑，采用CCK-8試劑盒測定并計算冰片對HaCaT細胞的半數(shù)抑制率（IC50），利用熒光漂白恢復技術測定不同濃度冰片對HaCaT細胞膜流動性的影響，采用流式細胞儀測定冰片對HaCaT細胞膜電位及細胞膜內Ca2+濃度的影響。結果 冰片和氮酮的藥物IC50分別為2.826、0.172 mmol/L；冰片可增加HaCaT細胞膜流動性，且隨著藥物濃度的增大而增加，呈劑量依賴性關系；冰片可降低HaCaT細胞膜電位和HaCaT細胞內Ca2+濃度，表現(xiàn)出類似氮酮作用特點。結論 冰片的經(jīng)皮促透作用機制可能與其影響角質細胞內Ca2+濃度進而改變活性表皮角質形成細胞膜電位和膜流動性有關。

關鍵詞：冰片；促透劑；細胞膜流動性；HaCaT細胞；細胞膜電位

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.018

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0062-05

Effects of Borneol on Membrane Fluidity and Membrane Potential of HaCaT Cell FU Da-li1， YONG Xiao-lan1， LIU De-fang1， XIAO Shuang2 （1.General Hospital of Chengdu Military Region， Chengdu 610083， China；2.Sichuan Provincial Peoples Hospital， Chengdu 610072， China）

Abstract：Objective To investigate the action mode of borneol on activity of epidermal skin；To investigate action mode of borneol as penetration enhancer. Methods The well-established and standard penetration enhancer Azone was employed as a positive control in this study. The cytotoxicities of borneol and Azone on HaCaT cells were detected by CCK-8 assay， and their half 50% inhibitory concentrations （IC50） were calculated. The fluorescence recovery after photo bleaching was employed to investigate the effect of borneol and Azone on membrane fluidity， and the flow cytometer was used to monitor the changes of membrane potential of HaCaT cell after treated with these penetration enhancers. Results The IC50 values of borneol and Azone were 2.826 ， 0.172 mmol/L， respectively. Borneol could significantly improve the membrane fluidity in a concentration-dependent manner， and effectively decrease the membrane potential of HaCaT cell， which exhibited the performances similar to those of Azone. Conclusion The penetration enhancement mechanism of borneol was associated with the concentrations of Ca2+ in keratinocytes， which changes the membrane fluidity and membrane potential of HaCaT cell.

Key words：borneol；penetration enhancer；membrane fluidity；HaCaT cell；membrane potential

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題（120573）

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（收稿日期：2014-08-17）

（修回日期：2014-08-26；編輯：華強）

冰片屬開竅藥，具有辛香走竄之性，能引藥由肌表直達腠理，在中藥外用制劑中應用廣泛，從而促進中藥外用制劑中有效成分透皮吸收，表現(xiàn)出類似現(xiàn)代經(jīng)皮制劑中的促透劑作用[1-2]。皮膚表皮作為藥物經(jīng)皮吸收的重要屏障，主要由角質層和活性表皮組成，關于冰片促透作用機制，有研究考察冰片對表皮角質層的影響[3-4]，但尚未闡明其對皮膚活性表皮的作用，目前也缺乏經(jīng)皮促透劑對皮膚活性表皮的促透作用機制研究。因此，本研究采用HaCaT細胞模型，測定冰片對HaCaT細胞膜流動性和膜電位的影響，研究其對皮膚活性表皮的影響，為進一步闡明冰片促進藥物透皮吸收的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

冰片，北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號20140422；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號NXF0650；青鏈霉素混合液，北京索萊寶科技有限公司，批號20130318；MEM/EBSS，賽黙飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號NYC0831；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索萊寶科技有限公司，批號20130313；氮酮，國藥集團化學試劑有限公司，批號F20110831；磷酸鹽緩沖液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號20130531；Invitrogen Incorporation，批號1313498；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8）， Dojindo，批號EJ744；Fluo3-AM，Dojindo，批號EX767；DiBAC4（3）熒光探針。

1.2 儀器

Multiskan GO全波長酶標儀（芬蘭Thermo公司），F(xiàn)V1000激光共聚焦掃描顯微鏡（日本奧林巴斯公司），BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國DB公司）。

1.3 細胞株與細胞培養(yǎng)

HaCaT細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。將HaCaT細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素混合液的MEM/EBSS培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法測定冰片HaCaT細胞毒性

收集對數(shù)期HaCaT細胞，以每孔7.0×103的細胞密度接種于96孔板，并設置空白組（PBS）、對照組（含0.5%DMSO培養(yǎng)基）及系列藥物組，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入系列不同濃度冰片及陽性對照藥氮酮。藥物作用24 h后移去培養(yǎng)基，加入1 mL含10 μL CCK-8試液培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應2 h。于酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度（A），并計算細胞存活率[（A藥物組-A空白組）÷（A對照組-A空白組）×100%]。根據(jù)系列不同濃度藥物細胞存活率及文獻方法，計算藥物半數(shù)抑制率（IC50）[5]。

1.5 細胞膜流動性的測定

利用激光共聚焦顯微鏡的熒光漂白恢復技術（FRAP）觀察并測定藥物作用HaCaT細胞后對細胞膜流動性的影響。以每孔15×104的細胞密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿，并設置空白組（正常培養(yǎng)基）、對照組（含0.5%DMSO培養(yǎng)基）及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組。置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，移去培養(yǎng)基，并用PBS小心清洗3遍，每孔加入0.5 mL 2 μL/mL NBD-C6-HPC熒光探針溶液培養(yǎng)0.5 h，然后再用PBS小心清洗3遍，置于激光共聚焦顯微鏡進行測定。儀器參數(shù)為：激發(fā)波長488 nm，接收波長530 nm，熒光漂白的激光功率100%，漂白時間900 ms，掃描頻率1.65 s，總掃描時間為120 s。記錄熒光漂白位置熒光漂白動畫，細胞膜流動性以熒光恢復率進行表征。熒光恢復率（%）=（F2-F1）÷（F1-F0）×100%。式中，F(xiàn)2為熒光漂白后的熒光值，F(xiàn)1為熒光漂白前的熒光值。F0為漂白后即刻熒光值熒光恢復率越大，細胞膜流動性越大。

1.6 細胞膜電位的測定

采用流式細胞儀測定冰片及陽性藥氮酮對HaCaT細胞膜電位的影響。將HaCaT細胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶內，設置空白組（正常培養(yǎng)基）、對照組（含0.5% DMSO培養(yǎng)基）及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組，待細胞貼壁后12 h分別加入對應藥物，置CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。用胰蛋白酶消化、離心，去除上清液后加入500 μL DiBAC4（3）熒光探針溶液（5 μg/mL），37 ℃孵育0.5 h，離心后棄上清液，用0.5 mL PBS分散后利用流式細胞儀進行細胞膜電位測定。儀器參數(shù)設置：激發(fā)波長488 nm，接收波長 530 nm，用未經(jīng)熒光物質孵育HaCaT細胞調零。

1.7 HaCaT細胞內Ca2+濃度的測定

將HaCaT細胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶內，并設置空白組（正常培養(yǎng)基）、對照組（含0.5% DMSO培養(yǎng)基）、及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組，待細胞貼壁后分別加入對應的藥物培養(yǎng)24 h。然后用胰蛋白酶消化，D-Hanks溶液稀釋并調整細胞密度為70×104/孔，離心去上清液，加入0.5 mL Fluo 3-AM （5 μmol），置培養(yǎng)箱孵育0.5 h后，采用流式細胞儀進行測定HaCaT細胞熒光強度。儀器參數(shù)設置：激發(fā)波長488 nm，接收波長520 nm。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冰片對HaCaT細胞存活率的影響

冰片和氮酮對HaCaT細胞存活率的影響大致呈濃度依賴性關系，根據(jù)細胞存活率計算冰片和氮酮IC50，分別為（2.826±0.261）、（0.172±0.003）mmol/L，見圖1。結果表明，相對于常用化學經(jīng)皮促透劑氮酮，冰片具有較低的細胞毒性，提示冰片作為經(jīng)皮促透劑可能具有較低的皮膚刺激性。其中，當冰片和氮酮濃度分別低于0.312、0.039 mmol/L時，對HaCaT細胞活性影響較低，因此，選擇0.300、0.200、0.100 mmol/L冰片及0.050、0.025、0.001 mmol/L氮酮分別作為高、中、低濃度考察其對HaCaT細胞膜流動性和膜電位的影響。

2.2 冰片對HaCaT細胞膜流動性的影響

采用熒光探針作用后激光共聚焦的熒光圖像，測定HaCaT細胞膜流動性之前先在細胞上選定熒光漂白部位（小圈），熒光漂白前可見HaCaT細胞膜熒光呈綠色且分布較為均勻，在利用激光漂白瞬間漂白部位的綠色熒光消失，然后由于細胞膜存在流動性，漂白周圍的熒光隨著細胞膜的流動性轉移到漂白區(qū)域，一段時間后，漂白部位熒光會有一定程度的恢復（見圖2）。同時，在漂白前到熒光恢復前記錄漂白區(qū)域內熒光強度值并得出熒光恢復曲線（見圖3）。然后，根據(jù)漂白區(qū)域內熒光漂白前后的熒光強度值計算細胞膜熒光恢復率，從而測定細胞膜流動性的大小。

由表1所知，正常HaCaT細胞膜的熒光恢復率為42.3%，以0.5%DMSO為溶劑的對照組的熒光恢復率為44.6%，說明采用0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對細胞膜流動性沒有顯著影響。在不同濃度氮酮作用下，細胞膜流動性均顯著增加（P<0.05），且隨氮酮應用濃度增加表現(xiàn)出細胞膜流動性增加作用。而在冰片作用下，HaCaT細胞膜流動性增加，且呈濃度依賴性，隨濃度增加而加強，表現(xiàn)出與化學促透劑氮酮相似的作用特點，表明冰片可增加HaCaT細胞膜流動性。

2.3 冰片對HaCaT細胞膜電位的影響

HaCaT細胞靜息狀態(tài)下，細胞膜內呈負電荷，膜外帶正電，從而在HaCaT細胞膜內外形成一定電勢差，熒光探針可在此電勢差作用下進行跨膜轉運。當細胞膜內外電勢差變弱時，轉運熒光物質相應減少，因此，可根據(jù)熒光探針熒光強度值判斷相應物質對細胞膜電位的影響。值得注意的是，DiBAC4（3）為帶負電荷探針，利用該熒光探針檢測到的熒光強度值越大，表明細胞膜表面電位越低[7]。

圖4為冰片高濃度組作用下流式細胞儀測定的HaCaT細胞膜電位代表圖譜，由表2可知，空白組與對照組熒光強度值未表現(xiàn)出明顯差異（P>0.05），說明0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對HaCaT細胞膜電位沒有顯著影響。而在中、高濃度氮酮作用下，所檢測的HaCaT細胞熒光值顯著增加，說明該濃度氮酮作用下HaCaT細胞膜電位降低，而低濃度氮酮未對HaCaT細胞膜電位產(chǎn)生影響。同樣，根據(jù)高、中、低濃度冰片對HaCaT細胞膜熒光值可知，低濃度冰片也未對HaCaT細胞膜電位產(chǎn)生顯著影響，但隨著冰片濃度增加，HaCaT細胞膜電位顯著降低，表現(xiàn)出類似氮酮的作用方式，提示冰片具有降低HaCaT細胞膜電位作用。

2.4 冰片對HaCaT細胞內Ca2+濃度的影響

分別給予高、中、低濃度冰片（3個濃度值的設置同細胞膜電位和流動性試驗），熒光強度值的變化反映細胞內Ca2+濃度的變化，從而測定冰片對細胞內Ca2+濃度的影響。圖5為冰片低濃度組作用下流式細胞儀測定的HaCaT細胞內Ca2+濃度的代表圖譜?？瞻捉M與對照組熒光強度值未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05），說明0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對細胞Ca2+濃度沒有顯著影響。由表3可知，高、中、低濃度氮酮作用下，HaCaT細胞Ca2+熒光強度值均顯著降低，提示氮酮可降低細胞內Ca2+濃度，而低濃度冰片對HaCaT細胞內Ca2+濃度未產(chǎn)生顯著影響，但隨著冰片濃度值的增加，熒光強度值降低，表現(xiàn)出類似氮酮的作用特點，說明冰片可降低HaCaT細胞內Ca2+濃度。

3 討論

皮膚主要由表皮、真皮和皮下組織組成，由于真皮層上部存在豐富的毛細血管網(wǎng)，藥物通透到達真皮后就很快被吸收，因此，皮膚表皮是藥物經(jīng)皮吸收的主要通透屏障。皮膚表皮由外向內可分為5層，即角質層、透明層、粒層、棘層和基層，其中，除已角化的角質層外，其他各層統(tǒng)稱為活性表皮。表皮實際上包含兩類細胞，即角質形成細胞（keratinocyte，約占95%）和非角質形成細胞（包括黑素細胞、朗格漢斯細胞以及梅克爾細胞等）。而HaCaT細胞作為一種重要的人表皮角質形成細胞，目前已成為外用透皮用藥研究的一種重要模型[6]。因此，本研究采用HaCaT角質形成細胞模型研究冰片對皮膚活性表皮的影響。此外，氮酮作為經(jīng)典的常用化學經(jīng)皮促透劑，已在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中作為皮膚滲透促進劑得到廣泛應用，也是經(jīng)皮促透劑促透效果評價的常用參照促透劑[7]，因此，本實驗選擇氮酮對比研究冰片對HaCaT角質形成細胞作用特點。

細胞膜內的脂質和蛋白分子具有一定流動性，細胞膜流動性的改變常伴隨著許多細胞功能的變化，如物質跨膜轉運、膜結合酶活性、配體與膜受體的結合、細胞的分化與細胞識別等方面[8]。相關研究也表明，一些經(jīng)皮促透劑可通過影響皮膚表皮角質細胞膜流動性，從而增強皮膚表皮細胞間流動性，利于藥物的透皮轉運吸收[6]。本研究結果提示，冰片具有增加角質形成細胞膜流動性作用，表現(xiàn)出與化學促透劑相似的作用特點，提示冰片可通過增加皮膚表皮細胞間流動性，從而降低藥物通透皮膚表皮的屏障作用。

細胞膜電位也是細胞膜最重要的生物物理學特征之一，其形成與細胞膜上各種離子泵的存在有關，在細胞膜內外有一定的離子濃度差，從而形成電勢差。細胞膜電位的改變常伴隨著相關細胞膜脂功能和結構的改變，如膜黏度、膜厚度、離子滲透等[9-10]。Hamman等[11]研究報告指出，皮膚表皮類似于上皮組織細胞，在細胞的緊密連接處存在一定負電荷。而一些經(jīng)皮促透劑可與這些負電荷產(chǎn)生一定相互作用，是其促進藥物向透皮吸收或向皮膚深層轉動的作用機制之一[6，12]。本研究結果顯示，冰片也具有降低表皮角質形成細胞膜電位作用，可能通過影響皮膚表面負電荷而改變皮膚活性表皮屏障作用，有利于藥物透過皮膚活性表皮層。

Ca2+作為細胞最古老、作用最廣泛的細胞信使之一，在人皮膚角質細胞增殖、分化等生理生化反應中均具有重要的調節(jié)作用[13]，而細胞內外Ca2+平衡被打破，將會改變角質細胞的膜流動性及其緊密連接程度、膜電位等[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，冰片及氮酮作用下，HaCaT細胞內Ca2+濃度都顯著降低，提示冰片增加表皮角質形成細胞膜流動性、降低細胞膜電位，可能與其對細胞內外Ca2+平衡影響有關，但相關作用機制有待進一步研究。

本實驗研究結果表明，冰片作為天然的經(jīng)皮促透劑不僅可影響表皮最外層角質層的屏障作用，還可影響角質形成細胞膜流動性和膜電位等降低皮膚活性表皮屏障功能，從而有利于藥物的經(jīng)皮吸收。同時，本實驗采用HaCaT細胞作為促透劑促滲機制研究模型，考察冰片對其細胞膜流動性和膜電位的影響，探索冰片促進藥物透皮吸收的相關作用機制，也為深入闡明經(jīng)皮促透劑作用機制的研究提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2014-09-16；編輯：華強）