許雅清第
摘要:目的 探討久瀉靈顆粒治療脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的作用機制。方法 采用灌服大黃水煎液+肌肉注射氫化可的松并結合2,4,6-三硝基苯磺酸+乙醇灌腸建立動物模型。將90只大鼠隨機分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組和久瀉靈顆粒7、14、21 d組,各治療組給予相應藥物干預。采用酶聯(lián)免疫法檢測各組大鼠血清及結腸組織中白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及干擾素-γ(IFN-γ)含量。結果 與空白組比較,模型組大鼠血清及結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量均升高(P<0.05);與模型組比較,各治療組大鼠血清及結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量均降低(P<0.05),其中久瀉靈顆粒21 d組作用最明顯(P<0.05)。結論 久瀉靈顆粒通過調節(jié)脾腎陽虛潰瘍性結腸炎模型大鼠IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的分泌達到抑制炎癥發(fā)生,從而保護結腸黏膜。
關鍵詞:久瀉靈顆粒;潰瘍性結腸炎;脾腎陽虛;白細胞介素-1;白細胞介素-6;腫瘤壞死因子-α;干擾素-γ;大鼠
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.017
中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2015)04-0059-04
Effects of Jiuxieling Granules on IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN- γ in Rats with Spleen Kidney Yang Deficiency Ulcerative Colitis XU Ya-qing1, LI Hai-long1,2, QIU Jia-quan1, JIA Yu-xin1, CHENG Xiao-li1, MING Hai-xia1, LIANG Yong-lin1, WU Yu-hong1 (1.Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;2.New Products of Gansu Province Chinese Medicine Engineering Laboratory, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)
Abstract:Objective To detect mechanism of action mode of Jiuxieling Granules in spleen and kidney yang deficiency ulcerative colitis. Methods The perfusion of Rhei Radix et Rhizoma Decoction plus intramuscular injection of hydrocortisone and combined with TNBS and ethanol enema were employed to establish UC animal model. Ninety rats were randomly divided into blank group, model group, SASP group and Jiuxieling Granules 7 days, 14 days and 21 days groups. All treatment groups received relevant medicine intervention. The levels of IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in serum and colon tissue were detected by ELISA. Results Compared with the blank group, the levels of IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in serum and colon tissues of rats in model group increased (P<0.05);compared with the model group, the levels of IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in serum and colon tissues of rats in treatment groups were reduced greatly (P<0.05), among which Jiuxieling Granules 21 days group showed the most obvious effects (P<0.05). Conclusion Jiuxieling Granules can regulate the normal secretion of the levels of IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in serum and colon tissue of model rats, and inhibit inflammation and protect colonic mucosa.
Key words:Jiuxieling Granules;ulcerative colitis;spleen and kidney yang deficiency;IL-1;IL-6;TNF-α;IFN-γ;rats
潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)又稱非
基金項目:國家自然科學基金(81260520)
通訊作者:吳玉泓,E-mail:yhw67@126.com
特異性潰瘍性結腸炎,具有治愈難度大、復發(fā)率高的特點,臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿血便及里急后重為主要表現(xiàn),被認為是結腸癌癌前病變[1]?,F(xiàn)代醫(yī)學針對UC多采用柳氮磺吡啶結合皮質激素進行治療,但療效并不理想。吳氏等[2]通過系統(tǒng)評價各數(shù)據(jù)庫文獻對UC中醫(yī)證候進行整理,結果發(fā)現(xiàn),脾腎陽虛型UC發(fā)生率位居UC各類證候之首。研究表明,此類患者宜用溫補脾腎類藥物以取脾腎雙補、標本同治之功,臨床治療效果良好[3]。本研究采用脾腎陽虛型UC模型大鼠,觀察久瀉靈顆粒對模型大鼠白細胞介素-1 (IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及干擾素-γ(IFN-γ)含量的影響,探討其治療脾腎陽虛型UC的作用機制。
1 實驗材料
1.1 動物
SPF級Wistar大鼠90只,體質量(180±10)g,雌雄各半,雄鼠鼠齡為40日齡左右,雌鼠鼠齡為45日齡左右,甘肅中醫(yī)學院實驗中心提供,動物合格證號SCXK(甘)2011-0001。
1.2 藥物
三硝基苯磺酸(TNBS,購自Sigma公司,批號111M5001V);柳氮磺砒啶(購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號120915);氫化可的松注射液(天津生物化學制藥有限公司,批號13060211)。大黃水煎液(藥材購自甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房,常規(guī)水煎后,按13.5 g原藥材/kg濃縮到濃度為1.35 g/mL)。久瀉靈顆粒按處方比例進行配伍(人參∶炒白術∶干姜∶炙甘草∶吳茱萸∶補骨脂∶肉豆蔻∶五味子=3∶3∶3∶3∶1∶4∶2∶2),甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑室加工。采用多功能提取罐,加水提取2次,加水量分別為藥材的8、6倍,時間為每次2 h;煎液過濾,濾液混合,濃縮至稠膏,按膏∶糊精∶糖粉=1∶0.5∶2配制,將配制的藥材進行制粒,烘干,整粒,檢驗,分裝即得。常溫干燥保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 主要試劑與儀器
IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒(批號20140301A),南京建成生物工程研究所。Benchmark Plus連續(xù)波長酶標儀(美國Bio-rad),高速冷凍離心機(Biofuge-Stratos),勻漿器。
2 實驗方法
2.1 分組與造模
適應性飼養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組和久瀉靈顆粒7、14、21 d組,每組15只。脾腎陽虛型模型參考文獻[4-5]造模。第1階段復制脾虛模型:上午灌服大黃水煎液,2 mL/(只·d),下午灌服蒸餾水2 mL/(只·d),連續(xù)14 d;第2階段在脾虛基礎上繼續(xù)復制脾腎陽虛模型:第15日在大鼠左右肢臀部交替肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d),并灌服蒸餾水2 mL/(只·d),連續(xù)10 d。第25日禁食不禁水,第26日用100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合試劑灌腸,復合法建立脾腎陽虛型UC大鼠模型。
2.2 給藥
成模后,空白組和模型組予生理鹽水灌胃,久瀉靈顆粒組與柳氮磺砒啶組分別給予久瀉靈顆粒和柳氮磺砒啶0.2 g/kg藥物灌胃,2 mL/只。等效劑量以成人常規(guī)劑量按人與動物體型系數(shù)折算[6],灌胃體積為1 mL/100 g體質量,每日1次,連續(xù)3周。
2.3 標本采集及處理
空白組、模型組、柳氮磺砒啶組大鼠分別于造模21 d末,久瀉靈顆粒組大鼠分別于造模7、14、21 d末采集血清/結腸組織,水合氯醛麻醉采血后斷頸處死制備標本。血清制備:股動脈取血,3000 r/min離心10 min,取血清置4 ℃冰箱保存,待測。結腸組織勻漿制備:截取結腸病變處,沖洗、稱重后剪碎,加9倍生理鹽水勻漿,12 000 r/min離心10 min,將上清分裝置4 ℃冰箱保存,待測。ELISA檢測血清及結腸組織IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量,具體操作參照試劑盒說明書。
3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,根據(jù)方差齊性檢驗結果,多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
4 結果
4.1 各組大鼠一般生存狀況
空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應靈敏,活動及飲食量正常,皮毛濃密柔順而有光澤,糞便呈棕褐色顆粒狀。模型組多數(shù)在第5日后開始出現(xiàn)蜷臥、瞇眼等部分癥狀,第10日后癥狀開始明顯,大鼠蜷臥扎堆,食量減少,體質量開始減輕,便形質軟,部分動物瞇眼弓背。往后動物癥狀逐漸加重,體質量明顯減輕,便形稀溏,肛周污穢,少食怠動,畏寒,成群蜷縮或弓背,毛發(fā)失去光澤而枯槁疏散。治療組第6日出現(xiàn)輕度蜷臥、瞇眼,第13日后出現(xiàn)少食怠動、體質量下降、便形質軟等,治療至16 d后上述癥狀開始減輕或消失,表現(xiàn)為反應較為靈敏,活動及飲食量增加,糞便部分呈顆粒狀,瞇眼弓背消失。造模過程中,模型組死亡2只,久瀉靈顆粒7、14 d組各死亡1只,柳氮磺吡啶組死亡2只,故檢測時每組統(tǒng)一選取10只。
4.2 久瀉靈顆粒對大鼠血清和結腸組織中白細胞介素-6和白細胞介素-1含量的影響
與空白組比較,模型組大鼠血清和結腸組織中IL-1、IL-6含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,各治療組大鼠血清及結腸組織中IL-1、IL-6含量明顯降低(P<0.05),其中久瀉靈顆粒21 d組作用顯著(P<0.05)。
4.3 久瀉靈顆粒對大鼠血清和結腸組織中腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ含量的影響
與空白組比較,模型組大鼠血清和結腸組織中TNF-α、IFN-γ含量升高(P<0.05);與模型組比較,各治療組大鼠血清及結腸組織中TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),其中久瀉靈顆粒21 d組作用最顯著(P<0.05)。結果見表3、表4。
5 討論
近年來研究表明,在UC的諸多發(fā)病機制中免疫因素至關重要,其中免疫調節(jié)異常導致的組織損傷受到廣泛關注。IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ等促炎癥細胞因子是公認的介導UC發(fā)病的細胞因子。IL-1及IL-6是一種能激活多種免疫和炎癥細胞的炎性細胞因子,其中IL-1β能促進血管內皮-白細胞黏附分子的表達,趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位,從而引起腸道炎癥反應和組織破壞[7]。TNF-α是一種17 000 Mr的非糖蛋白,主要由單核細胞、巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生,不僅能刺激巨噬細胞、纖維母細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和內皮細胞分泌花生四烯酸代謝物、肌酸激酶和蛋白酶,還能吞噬細胞產(chǎn)物和補體片段引起細胞壞死、間質中蛋白質破壞和水腫的發(fā)生,從而促進胃腸細胞的組織損害。IFN-γ是一種二聚體糖蛋白,由Th1淋巴細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生,它的免疫調節(jié)活性強,是強有力的吞噬細胞和中性粒細胞激活物[8],在炎癥反應中也參與的調節(jié)。
在UC發(fā)病機制中,可能是促炎因子表達增多、作用增強,從而產(chǎn)生一個異常的免疫應答反應,最終導致UC的發(fā)病,如TLR4介導脂多糖的信號傳導通路產(chǎn)生許多促炎因子IL-1、IFN-γ、IL-6、TNF-α等,同時這些促炎因子又會促使腸上皮細胞的TLR4及其輔助蛋白的表達增加,而且導致對脂多糖的敏感性增強,從而觸發(fā)和加重UC的發(fā)病[9]。
久瀉靈顆粒主治脾腎陽虛型UC,方用理中丸加四神丸而成,具有調理陰陽、燮理虛實、補腎溫腸、利濕止瀉的功能,全方體現(xiàn)攻澀兼施、辛開苦降、寒熱并投、升降協(xié)調四大特點。方中人參、炒白術、補骨脂溫補脾腎補虛治本,肉豆蔻祛濕利濁攻邪,還能行氣與人參、白術共奏行補之功,干姜、吳茱萸溫中散寒,五味子澀腸止瀉以治標,并收斂耗散之正氣。
本研究結果表明,久瀉靈顆粒能降低脾腎陽虛型UC模型大鼠血清和結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的表達,從而抑制炎癥及損傷的進一步發(fā)生,對結腸黏膜有明顯的保護作用。
參考文獻:
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