王飛燕 郭立佳 楊臘英 汪軍 王國(guó)芬 黃俊生

摘 ?要 ?為了研究尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種fpd1基因的功能，構(gòu)建了該基因敲除突變體并對(duì)其表型特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，與野生型菌株相比，fpd1基因敲除突變體生長(zhǎng)減慢，產(chǎn)孢量顯著降低，對(duì)巴西蕉的致病性明顯減弱;fpd1基因可能在尖孢鐮刀菌古巴?；偷漠a(chǎn)孢、生長(zhǎng)發(fā)育和致病性等方面具有重要作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究fpd1基因的功能和尖孢鐮刀菌的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?尖孢鐮刀菌古巴?；?fpd1基因;敲除;致病性;產(chǎn)孢

中圖分類號(hào) ?S482.2 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Construction and Phenotype Analysis of the fpd1 Deletion Mutants of the Fungal Pathogen Fusarium oxysporum f. sp. Cubense

WANG Feiyan1，2，GUO Lijia2，YANG Laying2，WANG Jun2，

WANG Guofen2，HUANG Junsheng1*

1 Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China

2 Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive

Alien Pests，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China

Abstract ?To investigate the function of fpd1 in Fusarium oxysporum f. sp. Cubense race 4（Foc4），the fpd1 deletion mutants were constructed and its phenotypic characteristics were analyzed. The results showed that the mutant had a slower growth rate on potato dextrose agar （PDA） plates， and reduced conidiation compared to the wild-type strain. Additionally，the mutants showed decreased pathogenicity to bananas（Musa spp. cv. Brazil）. Therefore the fpd1 gene in Foc4 plays an important role on conidiation，growth， pathogenicity. The data lay the foundation for further study on the function of fpd1 gene and the pathogenic mechanism in Foc4.

Key words ?Fusarium oxysporum f. sp. Cubense;fpd1 gene;Deletion;Pathogenicity;Conidiation

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.017

香蕉枯萎病又稱香蕉黃葉病、香蕉巴拿馬病，由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. Cubense）從香蕉根系侵入并造成維管束萎蔫和植株枯萎，是一種典型的土傳維管束病害，病原菌主要有1號(hào)和4號(hào)生理小種[1-4]。該病菌為制約香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病原菌之一，目前尚無(wú)理想的化學(xué)防治藥劑，生產(chǎn)上主要通過(guò)選育抗病品種予以防治[5]。

目前，已有許多學(xué)者對(duì)重要經(jīng)濟(jì)作物枯萎病害病原菌尖鐮孢的致病基因、毒力基因、致病相關(guān)基因等進(jìn)行了大量的研究[6-12]。香蕉枯萎病菌致病基因主要包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子基因、克服植物防御系統(tǒng)相關(guān)基因以及與鐮刀菌自身定殖能力相關(guān)的基因，如fmk1、ste12 、fow1、fow2和six1等[10-12]。將T-DNA插入突變體庫(kù)和基因敲除策略是鑒定尖孢鐮刀菌的重要致病基因的主要手段[13-15]。

關(guān)于尖孢鐮刀菌fpd1基因的研究主要集中于番茄?；?，對(duì)尖孢鐮刀菌番茄?；?fpd1基因的研究結(jié)果表明，其編碼的產(chǎn)物部分與非洲爪蟾（Xenopus laevis）的氯離子電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（chloride conductance regulatory protein， ICln）相似，為一種跨膜蛋白，是一個(gè)致病性相關(guān)基因[16-18]。而尖孢鐮刀菌古巴?；偷膄pd1基因具體功能則尚未見(jiàn)報(bào)道。

香蕉枯萎病原菌古巴專化型4號(hào)生理小種的fpd1基因全長(zhǎng)為1 013 bp，含有一個(gè)47 bp的內(nèi)含子，編碼序列長(zhǎng)度為966 bp。與 1 號(hào)生理小種相比，4號(hào)生理小種fpd1基因全長(zhǎng)多24 bp，兩者有31個(gè)核苷酸堿基位點(diǎn)存在差異，同源性為 99.3%[19]。

筆者采用DNA重組策略敲除香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種致病相關(guān)基因fpd1，構(gòu)建該基因敲除突變體，研究其對(duì)菌株產(chǎn)孢量、生長(zhǎng)和菌落形態(tài)等特征及致病力的影響，以完善該基因的具體功能研究，為尖孢鐮刀菌的致病機(jī)理研究提供基礎(chǔ)理論。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株和質(zhì)粒 ? 菌株為尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4號(hào)小種菌株B2。質(zhì)粒為pCT74質(zhì)粒，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究利用課題組保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基及試劑 ? PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂18 g/L，不加瓊脂為PDB培養(yǎng)基）;再生培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、蔗糖1.2 mol/L、瓊脂0.9%）;STC溶液[山梨醇1.2 mol/L、氯化鈣0.5%、Tris-HCl 100 mmol/L（pH7.0）、EDTA 25 mmol/L];PTC溶液[將40%（W/V）PEG4000溶于STC溶液，用過(guò)濾器（孔徑0.2 μm）進(jìn)行過(guò)濾];0.8 mol/L氯化鈉溶液;Driselase崩潰酶溶液（20 ?mg/mL，Sigma）和Lysing Enzyme溶壁酶（20 mg/mL，廣東省微生物研究所），均用0.8 mol/L氯化鈉溶液配制。

1.1.3 ?植物材料 ?供試香蕉品種為巴西蕉（Musa spp. cv. Brazil），由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?真菌基因組DNA提取 ? 將B2菌株接種于PDB培養(yǎng)基，于180 r/min、28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)5 d，過(guò)濾收集菌絲體用于基因組DNA提取。DNA提取采用CTAB法[20]。

1.2.2 ?fpd1基因敲除載體構(gòu)建 ?根據(jù)基因組測(cè)序序列分別設(shè)計(jì)fpd1基因5′和3′端同源臂特異引物對(duì)，分別標(biāo)記為fpd1-AF和fpd1-AR、fpd1-BF和fpd1-BR（表1）。以野生型B2（WT）基因組DNA為模板，分別用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得fpd1基因開(kāi)放閱讀框上游5′端和下游3′端同源臂DNA片段，分別標(biāo)記為A臂和B臂。PCR反應(yīng)體系如下：模板50 ng，引物濃度均為10 pmol/L，2×Taq PCR master Mix（TIANGEN）12.5 μL，用ddH2O將總體系補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10min，4 ℃保溫。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收PCR產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物分別連接于pMD19T載體，構(gòu)建pMD19T-A和pMD19T-B克隆載體;將克隆載體分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ組合進(jìn)行酶切，獲得5′端和3′端同源臂DNA，分別先后連接于經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶線性化的pCT74載體（其中含潮霉素抗性基因hph和GFP基因表達(dá)盒）中，構(gòu)建fpd1基因敲除載體;再用KpnⅠ和XbaⅠ從敲除載體上切下用于轉(zhuǎn)化的DNA片斷，即A+hph+GFP+B，回收純化備用。

1.2.3 ?尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體制備和DNA轉(zhuǎn)化 ? 從新活化的尖孢鐮刀菌平板中獲取7 mm菌餅，將其接種于PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床培養(yǎng)5 d;用滅菌的2層擦鏡紙過(guò)濾去除菌絲，獲得孢子懸浮液（濃度約為107 cfu/mL）;吸取2 mL孢子液接種于PDB培養(yǎng)基中，以28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)9～10 h;用滅菌的6層擦鏡紙收集菌絲，并用0.8 mol/L NaCl沖洗菌絲，充分洗滌;挑取黃豆大?。ㄖ睆郊s3 mm）的菌絲，加入崩潰酶和溶壁酶溶液各6 mL，以28 ℃、150 r/min消化酶解2～3 h;用滅菌的2層擦鏡紙過(guò)濾，收集濾液，于室溫中以3 500 r/min 離心10 min，棄上清;加30 mL STC重懸沉淀，于室溫中以3 500 r/min 離心10 min，棄上清;加入1～2 mL STC， 將原生質(zhì)體調(diào)整至濃度約為107 cfu/mL。

取5 μg上述酶切回收的DNA片段，即A+hph+GFP+B DNA片段，緩慢加到200 μL 原生質(zhì)體中，輕輕混勻，于室溫中靜置20 min;緩慢加1～1.25 mL 40% 的PTC溶液至管中，輕輕混勻，于室溫中靜置20 min;將上述反應(yīng)液加入100 mL冷卻至50 ℃左右的再生培養(yǎng)基（含有100 μg/mL Amp 和50 μg/mL 潮霉素B）中，混勻后，倒于培養(yǎng)皿上;于28 ℃中恒溫培養(yǎng)4～7 d 后獲得轉(zhuǎn)化子，并連續(xù)培養(yǎng)3代獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 ?fpd1基因敲除突變體的鑒定 ?采用CTAB法[20]提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后，將其作為PCR擴(kuò)增的模板;分別以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株B2基因組DNA為模板，根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。其中，引物F1和F2檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否在fpd1基因開(kāi)放閱讀框5′端發(fā)生同源重組;引物F5和F6檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否在fpd1基因開(kāi)放閱讀框3′端發(fā)生同源重組;引物F3和F4檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否存在fpd1基因開(kāi)放閱讀框，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度分別約1.3、1.4、0.8 kb（表1）。如果引物F1和F2、F5和F6 的PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性而引物F3和F4的 PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，則此轉(zhuǎn)化子即為fpd1基因敲除突變體。PCR反應(yīng)體系如下：模板100 ng，引物濃度均為10 pmol/L，2×Taq PCR master Mix（TIANGEN）12.5 μL，用ddH2O將總體系補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性 40 s， 55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。

1.2.5 ?突變體表型分析 ? 生長(zhǎng)速率測(cè)定：將敲除突變體與野生型菌株B2 的菌餅（約7 mm）分別接種于PDA平板上培養(yǎng)，每個(gè)菌株接種3個(gè)重復(fù)，5 d后測(cè)量菌落直徑。

產(chǎn)孢量分析：分別從長(zhǎng)有fpd1敲除突變體和野生型菌株B2（均培養(yǎng)了5 d） 的PDA平板上打7 mm的菌餅5個(gè)，放入含有20 mL 0.05% 吐溫-20的蒸餾水中，慢速搖5 min，然后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

突變體形態(tài)顯微鏡觀察：從PDB培養(yǎng)液中吸取少量菌液到載玻片上，制片后在熒光顯微鏡（FV1000，Olympus）下觀察拍照。

1.2.6 ?致病性測(cè)定及統(tǒng)計(jì) ? 選取長(zhǎng)勢(shì)相近的巴西香蕉苗（株高約10 cm，5～6片葉子）種植于一次性塑料碗中;將培養(yǎng)了5 d的fpd1敲除突變體和野生型菌株經(jīng)過(guò)濾離心回收孢子，并用蒸餾水制孢子懸液（約106 cfu/mL），每株苗澆50 mL孢子液，以無(wú)菌水澆苗作為對(duì)照，每個(gè)菌株致病性測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取10株幼苗;處理后，按常規(guī)方法栽培管理，并觀察植株的發(fā)病情況;4周后調(diào)查病害發(fā)生情況，將球莖從中間縱向切開(kāi)，觀察球莖褐變程度，記錄每株幼苗發(fā)病級(jí)數(shù)[20]。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2分析軟件對(duì)產(chǎn)孢量、菌落直徑大小和病情指數(shù)進(jìn)行顯著性分析。香蕉幼苗發(fā)病情況用病情指數(shù)表示，病情指數(shù)計(jì)算采用如下公式：

病情指數(shù)=100×∑（植株發(fā)病級(jí)數(shù)×對(duì)應(yīng)株數(shù)）/（植株發(fā)病最高級(jí)數(shù)×總株數(shù)）[20]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?fpd1基因敲除載體構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建的敲除載體pCT74-fpd1進(jìn)行酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ可從敲除載體pCT74-fpd1上切下約1 100 bp的DNA條帶，即A臂;用限制酶 EcoRⅠ和XbaⅠ可從載體上切下B臂，約1 004 bp;用KpnⅠ和和XbaⅠ限制酶可從載體上切下同源重組片段A+hph+gfp+B，與預(yù)計(jì)大小一致（圖1-A）。同時(shí)對(duì)載體的A臂和B臂進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果均可擴(kuò)增到1條1 kb左右的DNA同源臂（圖1-B）。將載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的DNA片段正確。這些結(jié)果表明fpd1基因敲除載體已構(gòu)建成功。

2.2 ?PCR鑒定fpd1 敲除突變體

經(jīng)再生培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選，共獲得10個(gè)轉(zhuǎn)化子。分別提取野生型菌株B2基因組DNA和轉(zhuǎn)化子基因組DNA，并以之為模板，分別用引物對(duì)F1/F2、F3/F4和F5/F6進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2-A）。結(jié)果顯示（圖2-B），以其中2個(gè)轉(zhuǎn)化子DNA為模板，用引物對(duì)F1/F2和F5/F6進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別獲得約1.3、1.4 kb 的DNA條帶（泳道1和2，4和5），與預(yù)計(jì)大小一致，而野生型菌株模板無(wú)此PCR擴(kuò)增條帶（泳道7和8）。用引物對(duì)F3/F4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以2轉(zhuǎn)化子基因組DNA和清水為模板均無(wú)擴(kuò)增條帶（泳道3、6和10），而以野生型菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增到約0.8 kb的DNA條帶（泳道9）。這些結(jié)果表明這2個(gè)轉(zhuǎn)化子的fpd1基因已被敲除，故將其分別命名為Δfpd1-1和Δfpd1-2。其中Δfpd1-1的孢子和菌絲熒光顯微鏡圖分別見(jiàn)圖2-C、D。

2.3 ?fpd1敲除突變體表型分析

將fpd1基因敲除突變體菌株Δfpd1-1、Δfpd1-2和野生型菌株B2分別接種于PDA平板上并培養(yǎng)5 d，測(cè)量其菌落直徑。結(jié)果表明，野生型B2菌落平均直徑（2.39 cm）大于敲除突變體菌株Δfpd1-1和Δfpd1-2的菌落平均直徑（1.89 cm和1.74 cm），而且差異極顯著（p<0.01）。此外，與野生型相比，突變體的菌落不能形成大量氣生菌絲（圖3-A、B）。

將Δfpd1-1、Δfpd1-2突變體和野生型菌株B2分別接種于PDA平板上培養(yǎng)5 d，計(jì)算單菌落產(chǎn)孢量。結(jié)果表明，2個(gè)突變體菌株單菌落產(chǎn)孢量（0.44×106和0.5×106）均極顯著（p<0.01）低于野生型B2菌株單菌落產(chǎn)孢量（1.67×106，圖3-C）。

綜合研究表明，fpd1基因敲除突變體菌絲生長(zhǎng)減慢，產(chǎn)孢量減少。由此可見(jiàn)，fpd1基因?qū)怄哏牭毒?號(hào)生理小種的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢具有重要的作用。

2.4 ?fpd1基因敲除突變體對(duì)巴西蕉的致病性

將fpd1基因敲除突變體菌株Δfpd1-1、Δfpd1-2與野生型菌株B2分別接種巴西蕉幼苗。根據(jù)病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，接種fpd1基因敲除突變體菌株Δfpd1-1和Δfpd1-2的巴西蕉幼苗平均病情指數(shù)（14.4和16.2）均極顯著（p<0.01）低于野生型菌株B2（61.3）（圖4）。由此可見(jiàn)，fpd1基因敲除導(dǎo)致尖孢鐮刀菌對(duì)巴西蕉的致病性減弱。

3 ?討論與結(jié)論

氯離子電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（ICln）是非洲爪蟾（Xenopus laevis）膜通道蛋白離子傳導(dǎo)孔的一個(gè)亞基，功能上與動(dòng)物溶脹相關(guān)的氯離子通道有關(guān)[16-17]。Kawabe等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與非洲爪蟾的氯離子電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白相似的番茄?；虵PD1蛋白是致病因子，該基因缺失會(huì)導(dǎo)致致病性減弱;而蛋白氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌古巴?；偷腇PD1蛋白與非洲爪蟾的氯離子電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白序列相似性僅為15.9%，與番茄?；虵PD1蛋白相似性為99.7%。因此，筆者推測(cè)尖孢鐮刀菌古巴?；偷腇PD1蛋白具有與番茄專化型FPD1蛋白相似功能，可能參與尖孢鐮刀菌的致病性。

筆者通過(guò)基因敲除的策略獲得了尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種的fpd1基因敲除突變體。通過(guò)表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，fpd1基因敲除突變體孢子產(chǎn)量降低，生長(zhǎng)較緩慢，即其在PDA平板上的菌落直徑小于野生型（圖3），這些結(jié)果與古巴?；偷膄gb1、ste12、fomps1等基因敲除突變體的研究結(jié)果相似[10-12，21]。同時(shí)筆者通過(guò)致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)fpd1基因敲除突變體的致病力明顯低于野生型，表明fpd1基因敲除導(dǎo)致其致病力降低，這與郭立佳等[22]報(bào)道的尖孢鐮刀菌古巴?；蚮gb1基因的研究結(jié)果相似。綜上分析，筆者認(rèn)為fpd1基因?qū)怄哏牭毒虐蛯；偷漠a(chǎn)孢、菌絲生長(zhǎng)情況以及致病性等方面具有調(diào)控作用。另外，根據(jù)尖孢鐮刀菌番茄專化型fpd1基因的相關(guān)研究結(jié)果，F(xiàn)PD1具有氯離子電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白部分相似結(jié)構(gòu)，是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此，筆者推測(cè)尖孢鐮刀菌古巴?；涂赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控離子跨膜運(yùn)輸影響其產(chǎn)孢、菌絲生長(zhǎng)情況和致病力。關(guān)于fpd1基因突變體致病性減弱的具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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