劉如秀等

摘要：目的 觀察地黃主要有效成分梓醇對模擬缺血再灌注損傷兔竇房結(jié)細胞凋亡及細胞骨架β-微管蛋白（β-tubulin）的影響，探討其治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的機制。方法 取新生乳兔竇房結(jié)細胞，分為正常組、模型組及梓醇高、中、低劑量組。以缺氧缺糖模擬缺血、恢復氧和糖的供應模擬再灌注造成竇房結(jié)細胞損傷模型。正常組與模型組給予等體積培養(yǎng)基，梓醇高、中、低劑量組給予終濃度為100、20、10 μg/mL藥物，應用酶標儀、流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡觀察各組竇房結(jié)細胞凋亡率、β-tubulin的形態(tài)變化。結(jié)果 模型組細胞凋亡率較正常組明顯增加（P<0.01），β-tubulin裂解明顯。與模型組比較，梓醇高、中、低劑量組細胞凋亡率明顯降低（P<0.01），β-tubulin結(jié)構(gòu)明顯完整，熒光強度明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 梓醇抑制模擬缺血再灌注引起的竇房結(jié)細胞凋亡，保護竇房結(jié)β-tubulin形態(tài)可能是地黃治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的機制之一。

關鍵詞：梓醇；竇房結(jié)細胞；缺血再灌注；細胞凋亡；β-微管蛋白；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0059-04

Effects of Catalpol on Apoptosis and β-Tubulin of Rabbit Sinoatrial Node Cells in Vitro Injured by Simulated Ischemia Reperfusion LIU Ru-xiu， PENG Jie， LIU Yu， LIU Jin-feng， WANG Yan-li （Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract：Objective To observe the effects of catalpol， the effective component of Rehmanniae Radix， on atrionector cell apoptosis and β-tubulin in vitro rabbit injured by simulated ischemia reperfusion；To explore the mechanism of treating sick sinus syndrome. Methods Atrionector cells were collected from newborn rabbits. Cells were divided into 5 groups：normal group， model group， catalpol high， medium and low dose groups. Anoxia and aglycaemia were established to simulate ischemia. Atrionector cellular damage models were established by recovering the supply of oxygen and sugar. Normal control group and model group were given the same volume of culture medium， while catalpol high， medium and low dose groups were given medicine with relevant concentrations （100， 20， 10 μg/mL， respectively）. ELISA， FCM， laser scanning confocal microscopy were used to observe apoptosis rate and β-tubulin of atrionector in each group. Results Apoptosis rate of the model group was obviously higher than the normal group （P<0.01）， and β-tubulin cleavage was obvious. Apoptosis rate in catalpol high， medium and low dose groups were significantly lower than that of the model group （P<0.01）；β-tubulin structure were significantly more complete compared with the model group；the fluorescence intensity was significantly higher than that of model group （P<0.01）. Conclusion Catalpol can inhibit atrionector cellular apoptosis caused by simulated ischemia reperfusion. Its protective effects on atrionector β-tubulin may be the mechanism of the treatment of Rehmanniae Radix for sick sinus syndrome.

Key words：catalpol；atrionector cell；ischemia reperfusion；apoptosis；β-tubulin；rabbits

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（以下簡稱“病竇”）是臨床難

基金項目：國家自然科學基金（81173447）

治性重大心血管疾病，至今尚無有效根治措施。中醫(yī)藥治療病竇從整體入手，通過多種作用環(huán)節(jié)緩解病情，可改善患者的生存質(zhì)量，提高生存率，延長壽命。病竇的病機多為心腎陽虛、瘀血阻滯。然善補陽者，必于陰中求陽，且病竇患者久病傷陰，地黃性涼甘潤而能滋陰生血，為治療病竇的常用中藥[1]。梓醇（catalpol）是地黃的主要有效成分之一，有研究顯示，梓醇具有對抗神經(jīng)細胞凋亡、細胞氧化性損傷、炎癥反應等作用[2-4]，但目前鮮見對竇房結(jié)細胞凋亡和細胞骨架蛋白的研究。本研究從降低細胞凋亡率、保護細胞骨架β-微管蛋白（β-tubulin）兩方面揭示梓醇對模擬缺血再灌注損傷兔竇房結(jié)細胞的保護機制，為臨床運用地黃治療病竇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

出生24 h內(nèi)新西蘭乳兔8只，雌雄不拘，北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，合格證號11401400000095。

1.2 藥物

梓醇，中國藥品生物制品檢定研究院，批號110808- 201210。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基，美國Thermo公司；一抗：anti-beta tubulin antibody，美國Sigma公司；二抗：Gote Anti-Mouse IgG（H+L）Rhodamine（TRITC），美國Bioworld公司；胎牛血清，美國Gibco公司；低糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胰酶，美國Gibco公司。流式細胞分析儀（BD，美國），TCS-NT型激光共聚焦顯微鏡（德國），TMC63544防震臺（美國）。

1.4 竇房結(jié)細胞的分離與培養(yǎng)

新生24 h內(nèi)乳兔8只，吸入乙醚麻醉，用75%酒精消毒乳兔皮膚及手術區(qū)，置于冰面上。沿前正中線剪開胸腔，暴露心臟，將心底部大血管剪斷，游離心臟，盡量保留大血管，用PBS清洗心臟3遍，直至無余血。在解剖鏡下分離竇房結(jié)區(qū)域，用PBS清洗分離的組織，將清洗后的組織置于培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪碎，約0.5 mm大小，盡量于冰面上操作。將剪碎的組織置于5 mL離心管中，加入0.1%胰酶10 mL，37 ℃消化15 min，每隔5 min輕搖1次，查看情況，消化完畢，加入5 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，用移液槍上下吹打70次，400 r/min離心5 min，上清液移入另一50 mL離心管，將沉淀組織塊再加入0.1%胰酶10 mL，同前法消化，終止消化后，吹打，離心，取上清細胞懸液與第1次細胞懸液合并，重復1次，將3次所得細胞懸液合并至50 mL離心管，1500 r/min離心10 min，棄上清液，用含血清培養(yǎng)基6 mL重新懸浮細胞。取4個10 cm培養(yǎng)皿，各加入10 mL培養(yǎng)基，將細胞懸液等分移入培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，光鏡下觀察可見大量纖維細胞，間質(zhì)細胞貼壁，將上浮細胞取出，置于另4個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后更換新培養(yǎng)基，之后每48 h更換培養(yǎng)基[5]。

1.5 造模與分組

以缺氧缺糖模擬缺血，以恢復氧和糖的供應模擬再灌注。用不含胎牛血清的低糖培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基，放入自制密閉盒中，持續(xù)通入氮氣，充分排盡盒內(nèi)空氣，缺氧缺糖以模擬缺血。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后從密閉盒中取出，更換為正常培養(yǎng)基，恢復氧和糖的供應以模擬再灌注培養(yǎng)3 h。將細胞分為正常組、模型組和梓醇高、中、低劑量組。梓醇高、中、低劑量組分別加入相應濃度藥物（終濃度分別為100、20、10 μmol/mL）預先培養(yǎng)過夜（約8 h），造模更換培養(yǎng)基時加入相應濃度藥物，造模后取竇房結(jié)細胞實驗。

1.6 細胞活力測定

將細胞接種于96孔板中，分組、造模后，棄培養(yǎng)基，相應檢測孔內(nèi)加入MTT工作液100 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，取出，吸除MTT工作液，加入DMSO 100 μL，搖勻，待顏色變化，于酶標儀波長570 mm處檢測。

1.7 細胞凋亡測定

調(diào)整待測細胞濃度為5×105～1×106個/mL。造模后，將細胞消化移至離心管內(nèi)，4 ℃、1500 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，同上法離心，棄上清，重復3～4次，加入200 μL Binding Buffer，輕輕震蕩，使細胞懸浮。加入10 μL Annexin V-FITC，輕輕搖勻，避光，室溫反應15 min，加入5 μL碘化丙啶，上機檢測。

1.8 細胞骨架β-微管蛋白形態(tài)觀察

14 mm蓋玻片放入24孔板中進行細胞爬片，細胞貼壁后，選取生長良好細胞進行實驗。吸除培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min；吸除多聚甲醛，加入0.02%Triton，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置15 min打孔。PBS清洗3次，每孔加入相應一抗（1∶500 PBS溶液）100 μL，放入濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱孵育過夜；PBS清洗2次，加入二抗（1∶200 PBS溶液）常溫孵育1 h，甘油封片后上機檢測。取得圖像后，采用Image-Pro Plus 6.0進行平均熒光強度分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間資料采用完全隨機方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對竇房結(jié)細胞活力的影響

MTT比色檢測結(jié)果顯示，模型組活細胞量低于正常組（P<0.01），表明造模方法可行。梓醇高、中劑量組活細胞量高于模型組（P<0.01），且呈量效關系。結(jié)果見表1。

2.2 梓醇對竇房結(jié)細胞凋亡的影響

模型組細胞凋亡率明顯高于正常組（P<0.01）；梓醇高、中、低劑量組細胞凋亡率明顯低于模型組（P<0.01），且呈量效關系，見表1。流式細胞圖結(jié)果見圖1。

2.3 梓醇對竇房結(jié)細胞骨架蛋白的影響

模型組平均熒光強度明顯低于正常組（P<0.01）；梓醇高、中劑量組平均熒光強度高于模型組（P<0.01），梓醇低劑量組平均熒光強度與模型組比較無明顯差異，見表1。鏡下觀察結(jié)果顯示，正常組細胞內(nèi)細胞骨架染色清晰，骨架完整，分布均勻，線條清晰，基本充滿細胞質(zhì)；模型組竇房結(jié)細胞骨架排列紊亂，數(shù)量減少；梓醇高劑量組細胞骨架較模型組數(shù)量明顯增多，排列有序；梓醇中劑量組細胞骨架尚完整，但數(shù)量較正常組有所減少；梓醇低劑量組細胞骨架形態(tài)與模型組比較無明顯差異。結(jié)果見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.梓醇高劑量組；

D.梓醇中劑量組；E.梓醇低劑量組（下同）

3 討論

細胞凋亡在心臟傳導系統(tǒng)的發(fā)育成熟中具有重要作用，竇房結(jié)、房室結(jié)與傳導阻滯細胞的胚胎發(fā)育及出生后數(shù)周的發(fā)育過程中均有細胞凋亡發(fā)生，在竇房結(jié)的發(fā)育、成熟過程中，凋亡不足可留下引發(fā)心率失常的基礎，凋亡過度可引起病竇等病變[6]。1993年，Engler等首次從形態(tài)學和生物化學方面證實，缺血再灌注心肌中存有凋亡細胞[7]。近年來，隨著方法學的進步和凋亡研究的深入，已發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡之間有著密切的關系，并且在心臟的生理、病理發(fā)展過程中起重要作用，被認為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細胞學基礎[8]。細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要形式，抑制細胞過度凋亡則有防止缺血再灌注損傷的作用[9]。可見，缺血再灌注所致的竇房結(jié)細胞凋亡是病竇的發(fā)病機制之一。

心肌骨架系統(tǒng)破壞是缺血再灌注損傷主要的發(fā)生機制之一[10]，有研究表明，人心肌細胞缺血10 min，微管即發(fā)生排列紊亂[11]。微管是細胞骨架系統(tǒng)中的主要成分之一，是由微管蛋白組成的長管狀細胞器結(jié)構(gòu)，β-tubulin是主要的微管蛋白之一。微管由13條原纖維組成，形成相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，多數(shù)微管纖維處于動態(tài)的組裝和去組裝狀態(tài)，通過此過程以實現(xiàn)其功能。微管形成細胞內(nèi)網(wǎng)狀支架，維持細胞形狀，支持與固定細胞器的位置，同時，微管與細胞運動和細胞器位移有關[12]；另外，微管還通過調(diào)控細胞膜上L-鈣電流，參與細胞的電生理活動[13-15]。缺血再灌注可導致微管破壞，損傷胞質(zhì)中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導致細胞膜脆性增加、失去支持，同時胞質(zhì)中亞單位線粒體因失去骨架固定與支持發(fā)生移位，從而加速細胞損傷?？梢?，缺血再灌注可導致細胞骨架破壞，從而影響細胞形態(tài)和功能。

本實驗MTT檢測結(jié)果顯示，模型組與正常組存活細胞量有明顯差異，表明造模方法可行；梓醇高、中、低劑量組存活細胞量明顯高于模型組，表明藥物濃度選取有效可行。流式細胞檢測結(jié)果顯示，模型組細胞大量凋亡，表明缺血再灌注是導致竇房結(jié)細胞凋亡的可能原因。梓醇高、中劑量組細胞凋亡率明顯低于模型組，顯示梓醇對抗細胞凋亡是地黃等藥物治療病竇的可能機制之一。

顯微鏡觀察顯示，正常組細胞內(nèi)β-tubulin排列較整齊，且分布均勻，線條較清晰，基本充滿細胞質(zhì)；模型組β-tubulin數(shù)量較正常組明顯減少，表明缺血再灌注使β-tubulin裂解損傷。β-tubulin的破壞能損傷胞質(zhì)中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細胞膜脆性增加、失去支持；同時，胞質(zhì)中亞單位線粒體因失去骨架支持和固定發(fā)生移位，細胞膜上L-鈣電流調(diào)控出現(xiàn)紊亂，從而使竇房結(jié)細胞在電生理功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)生病理改變。而梓醇高、中、低劑量組β-tubulin都有不同程度增加。

綜上，梓醇保護細胞骨架β-tubulin是地黃等中藥治療病竇的可能機制之一。

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（收稿日期：2015-01-13）

（修回日期：2015-01-29；編輯：華強）