曹天駿等

摘 要 堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子在真核生物的生長發(fā)育過程中起著重要的調控作用。在前期龍血樹轉錄組測序結果基礎上克隆了1個海南龍血樹bHLH轉錄因子基因，命名為DcbHLH1。序列分析顯示，DcbHLH1閱讀框基因序列長1 080 bp，編碼360個氨基酸，推測分子量為39 ku，等電點為8.21。氨基酸序列比對結果顯示，DcbHLH1具有bHLH轉錄因子家族保守的HLH結構域。進化分析結果表明，DcbHLH1和中?？Х戎械腷HLH親緣關系最近。定量PCR結果表明，DcbHLH1在誘導劑處理后3 d內表達量快速下降，到第6天達到最低，與轉錄組測序的數字表達譜一致。DcbHLH1在海南龍血樹的根、莖、葉等組織中均有表達，但在葉中表達量較高，根中表達量最低。結果為進一步分析DcbHLH1在龍血樹中的功能奠定了基礎。

關鍵詞 海南龍血樹；bHLH轉錄因子；克?。徊町惐磉_

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

Cloning and Expression of DcbHLH1 in Dracaena cambodiana

CAO Tianjun1，2，DAI Haofu2， LI Huiliang2， GUO Dong2

MEI Wenli2 *， PENG Shiqing2 *

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agricultur， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Basic/helix-loop-helix gene（bHLH）is a transcription factor in the regulation of plant growth and development. In this study， a new gene coding for bHLH， designated as DcbHLH1， was cloned using the result of RNA-seq. Sequence analysis revealed the full-length cDNA of DcbHLH1 is 1 080 bp， encoding 360 amino acid residues with molecular mass of 39 ku， and pI 8.21， predicted tertiary structure contained a structure of helix-loop-helix. Evolution analysis showed that the DcbHLH1 and bHLH of Coffea canephora were the closest relative. The results of real time PCR analysis indicated that DcbHLH1 expressed at different levels with the highest transcription in the leaf， followed by the stem， and lowest in the roots. And the transcription of DcbHLH1 was decreased strongly in the stem by injection of induction solution at 3 days and 6 days. This research lays a foundation for studying the gene expression pattern and corresponding regulating mechanisms.

Key words Dracaena cambodiana； Basic/helix-loop-helix transcription factor； Clone； Differential expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.009

血竭是一種紅色樹脂，古今中外被廣泛的應用在傳統(tǒng)醫(yī)學當中[1]。海南龍血樹（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.）是國產血竭基源植物之一[2]。海南龍血樹主要分布在海南省的三亞、陵水、萬寧等地，國外也有較少的分布。天然血竭具有廣泛的藥用活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、止血、止腹瀉、抗?jié)兊然钚訹3]。化學成分分析表明，血竭中富含黃酮類物質，如黃酮、黃烷、查爾酮、高異黃酮等[4-8]。早期的研究表明，真菌能夠誘導龍血樹產生血竭[9-10]，但對于龍血樹中這類黃酮物質的大量產生和積累機理并不清楚。同時在龍血樹組織培養(yǎng)技術發(fā)展過程中發(fā)現(xiàn)海南龍血樹組培苗能在6-BA刺激下產生血竭[11-12]。故可推測是植物體對抗外界不適宜環(huán)境所發(fā)生相應的保護反應產生的。本課題組利用自主創(chuàng)新的“無機鹽誘導劑輸液法”成功誘導了海南龍血樹莖部黃酮物質積累（專利申請中）。黃酮類物質代謝是植物抗病機理中重要的代謝途徑。黃酮類化合物的合成底物來自于苯丙素代謝產生的香豆酰CoA和脂肪酸代謝產生的丙二酰CoA，然后經過一系列其他骨架合成酶和結構修飾酶的作用，形成結構不同，活性不同的黃酮類化合物[13]。

目前對血竭的研究主要集中在化學成分和藥理分析，而對血竭形成的分子機制尚未見報道[14-15]。本課題組利用無機鹽誘導劑處理海南龍血樹，并對誘導前后龍血樹樹干進行了轉錄組測序分析，旨在通過轉錄組高通量模式挖掘血竭形成的功能和調控基因，從分子水平闡明血竭的生物合成及其調控機制。本研究運用轉錄組數據，成功克隆了1個海南龍血樹堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix， bHLH）轉錄因子基因DcbHLH1，并進行了相關生物信息學和表達分析，為進一步研究龍血樹中bHLH轉錄因子在黃酮類生物合成途徑中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3年生海南龍血樹種植于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，采集根、莖、葉后立即用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit和實時熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均購自TaKaRa公司。E.coli DH5α由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 海南龍血樹bHLH基因的搜索和分析 對無機鹽誘導劑處理前后的3年生海南龍血樹莖轉錄組進行測序分析，通過Swissprot、非冗余核酸數據庫、非冗余的蛋白數據庫和京都基因與基因組數據庫（KEGG）公共數據庫（E≤1×10-5）比對獲得了注釋結果。根據KEGG注釋的基因功能信息，對參與次生代謝的序列（按次生代謝物種類）進行分類。再對所有注釋信息進行整理，搜索數字表達譜中轉錄因子中變化差異較大的基因。

1.2.2 海南龍血樹總RNA的提取和cDNA合成

取健康海南龍血樹的根、莖、葉，在液氮中研磨，依據蔡文偉等[18]方法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度儀測定含量和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作將總RNA反轉錄為第一鏈互補鏈DNA（cDNA）。

1.2.3 海南龍血樹DcbHLH1的克隆 從龍血樹轉錄組數據中獲得1個由13條表達序列標簽拼接而成的1 180 bp的序列，經注釋分析發(fā)現(xiàn)此序列是具有完整開放閱讀框和保守的bHLH結構域，定名為DcbHLH1。依據其兩端序列設計一對引物（表1），以cDNA為模板對DcbHLH1進行擴增。反應體系：在0.2 mL離心管中加入1 μL cDNA、10×PCR反應緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物純化后克隆至載體pMD19T上，轉化大腸桿菌DH5α，抽提質粒，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 DcbHLH1信息學分析 采用ExPASy Proteomics Server在線工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）對DcbHLH編碼蛋白的理化性質預測；利用http：//www.predictprotein.org/和http：//swissmodel. expasy.org/在線分析DcbHLH1二級結構和結構域的三維建模；利用ClustalW軟件和MEGA 5.2軟件進行氨基酸序列比對和構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 海南龍血樹DcbHLH1的表達分析 根據熒光定量引物設計原則，在不保守區(qū)域內設計DcbHLH1的定量引物（表1），以海南龍血樹ACT基因[19]作為內參基因，使用SYBR Green I 熒光染料法進行分析。每個樣品設3個重復。反應體系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板（50 mg/L）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，總體10 μL。反應程序： 95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性30 s， 59 ℃退火/延伸30 s，45個循環(huán)； 95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線分析，每個溫度以每步0.5 ℃上升，每個溫度停留5 s。試驗數據通過Excel進行分析，獲得DcbHLH1的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 DcbHLH1的克隆

根據轉錄組數據，通過PCR方法獲得1個1 080 bp的DcbHLH1（圖1）。序列分析結果表明，獲得的序列與轉錄組數據一致。

2.2 DcbHLH1編碼蛋白特性分析

DcbHLH1全長1 080 bp，編碼360個氨基酸（圖2）。推導的DcbHLH1相對分子質量為39 ku，等電點pI8.21； 帶正電殘基（Arg+Lys）為43，負電殘基（Asp+Glu）為45。該蛋白的不穩(wěn)定系數為60.74，脂肪系數為78.08，親水性系數為-0.470。二級結構在線預測結果表明，有73 個氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的20.33%，有32個氨基酸參與形成伸展鏈（extended strand），占總氨基酸的8.91%，另有255 個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸的70.75%。利用SWISS-MODEL 進行三維結構預測，該模型有bHLH轉錄家族共有的螺旋環(huán)螺旋結構（圖3），以1nkp.2.C（1.80 A）蛋白為模板，序列同源性為30%。

2.3 DcbHLH1蛋白序列比對及進化分析

對海南龍血樹、油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、小果野芭蕉（Musa acuminata）、小米（Setaria italica）、荷花（Nelumbo nucifera）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、節(jié)節(jié)草（Aegilops tauschii）、蘋果（Malus domestica）、中?？Х龋–offea canephora）、野草莓（Fragaria vesca）等13個物種的22個bHLH進行了同源比對，發(fā)現(xiàn)在DcbHLH1的172到231號氨基酸存在核心的HLH結構域（圖4）。對這22個不同物種的bHLH進行分子進化分析， 發(fā)現(xiàn)DcbHLH1和中?？Х菴cbHLH1的親緣關系最近，與同是單子葉植物的玉米、大麥、水稻親緣關系較遠（圖5）。

2.4 DcbHLH1的表達分析

qRT-PCR結果表明，DcbHLH1在未處理的健康海南龍血樹中表達量較高，在誘導處理的3 d內表達水平顯著降低，到第6天時基因表達量最低，為對照組表達水平的0.013倍（圖6）。與課題組前期的數字表達譜結果一致。DcbHLH1在所有組織中均有表達，其中在葉中表達量最高，莖次之，在根中表達量最低。

3 討論與結論

bHLH轉錄因子是一類含有眾多成員的重要轉錄因子，其結構域具有與DNA結合和與bHLH蛋白形成同源或異源二聚體的能力，在植物和動物中都有十分重要的轉錄調控作用[16-19]。在植物中bHLH通常識別靶標DNA上的E-box（由6個堿基CANNTG排列的特殊回文序列）[18]。植物bHLH轉錄因子既可以作為轉錄激活子又能作為轉錄抑制子發(fā)揮生物學作用，并且作用方式多種多樣。在擬南芥中bHLH轉錄因子能和R2R3類的MYB、WD40轉錄因子形成調控復合體，調控擬南芥中黃酮類化合物的生物合成[16]。在玉米中也發(fā)現(xiàn)bHLH轉錄因子調控種子和根中的黃酮代謝途徑[17]。Valderrama等[20]發(fā)現(xiàn)在草莓成熟過程中bHLH的表達量變化與著色變化一致，推測其在黃酮類物質合成中起著主要的調控作用。將玉米調控莖干顏色的bHLH基因轉化到矮牽牛花中，強烈地促進了植物花萼的著色[21]，表明bHLH基因參與了次生代謝調控。在蘋果和梨等果樹中， bHLH參與了低溫和紫外線誘導的花青苷的合成， 促進果實著色[22-23]。另外，擬南芥中發(fā)現(xiàn)茉莉酸途徑中JAZ蛋白負調控下游bHLH（JAM1）轉錄因子活性[24]，揭示bHLH又受到植物抗逆激素信號途徑上游調控因子的作用。外界環(huán)境能通過bHLH影響植物體內黃酮類物質的含量，其調控機制還需進一步研究。

本研究利用海南龍血樹轉錄組數據，克隆了一個龍血樹bHLH的基因DcbHLH1。DcbHLH1具有保守的HLH結構域，與其它植物的bHLH轉錄因子具有較高的同源性，表明該結構域在分子進化過程中具有較高的穩(wěn)定性，這可能與其在不同植物的生理代謝中行使同一功能相關。DcbHLH1能夠快速、顯著地響應植物體內微環(huán)境的變化，DcbHLH1的組織特異性表達與龍血樹中黃酮類化合物分布吻合，而DcbHLH1在處理后的表達明顯降低。bHLH類轉錄因子在很多植物中都證明參與黃酮類化合物代謝的調控[25-27]，推測DcbHLH1可能作為1個負調控因子參與了龍血樹中黃酮代謝途徑。目前還未見到龍血樹中血竭合成調控分子機制的報道，筆者下一步將對DcbHLH1基因的功能進行深入研究，為進一步闡明DcbHLH1蛋白在海南龍血樹中血竭合成的調控機制奠定基礎。

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