陳艷芳，劉培慶

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510260;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)通過調(diào)節(jié)血管收縮在高血壓、心肌肥厚和心室重構(gòu)等病理過程中起關(guān)鍵作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)［1-2］，AngⅡ?qū)λソ咝呐K的心肌能量代謝調(diào)節(jié)也產(chǎn)生了不利影響，通過降低心肌能量代謝的效率，減弱心臟收縮功能，從而加劇衰竭心臟左室重構(gòu)的進展。然而，當(dāng)前研究對于AngⅡ影響心肌能量代謝的機制并不明確。受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140，RIP140)和過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)是調(diào)控心肌能量代謝的重要轉(zhuǎn)錄輔助因子，本文以乳鼠心肌細(xì)胞為研究對象，探討RIP140與PGC-1α在AngⅡ調(diào)節(jié)線粒體產(chǎn)能中的作用，為確定RIP140與PGC-1α作為調(diào)控心肌能量代謝新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、蛋白定量酶標(biāo)儀(美國BioRad公司);RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量分析試劑盒(日本TaKa-Ra);發(fā)光液、核蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);RIP140抗體(英國Abcam公司);AngⅡ、胰蛋白酶、histone(美國Sigma);PGC-1α抗體(Calbiochem);RIPA蛋白裂解液(南京碧云天生物技術(shù)有限公司);ATP含量測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥有限公司)。

1.2乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)取出生后1～2 d SD大鼠，開胸取出心臟，用PBS沖洗后將心臟剪成1 mm3左右小塊。瞬時離心后棄去上清，加入15 mL 0.08%的胰蛋白酶于37℃水浴消化5 min。收集上清至等量含15%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清。沉淀用含1～2 mL胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。剩余未消化的組織塊繼續(xù)加入胰酶消化，如此重復(fù)5～6次直至組織塊呈白色為止。最后，離心收集總的細(xì)胞沉淀，重懸，接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，收集培養(yǎng)瓶中富集心肌細(xì)胞的懸液，計數(shù)種板，并在培養(yǎng)基中加入0.1 mol·L-1的BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長。

1.3Western blot分析利用核蛋白試劑盒提取心肌細(xì)胞核蛋白，考馬斯亮藍定量后分裝50 μg蛋白留作上樣。配置8%的分離膠和5%的濃縮膠，70 V下分離30 min，于120 V電壓下繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底部。220 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，用5%牛奶室溫封閉1 h，然后加入RIP140(1∶1 000稀釋)、PGC-1α(1 ∶800稀釋)等抗體，4℃孵育過夜。二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室下加入生物發(fā)光液顯影、定影。采用GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、Quantity one軟件對條帶進行灰度分析，以組蛋白histone為內(nèi)參蛋白作為對照。

1.4心肌細(xì)胞線粒體ATP濃度測定螢火蟲熒光素酶能催化ATP依賴性熒光素的氧化，經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素的光能，利用生物發(fā)光儀(檢測波長560 nm)進行檢測，所測得的熒光RLU值與ATP的含量呈線性正相關(guān)。將試劑盒中的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為 0.5、2、10、50 和 100 μmol·L-1五個濃度梯度，以縱坐標(biāo)為ATP濃度，橫坐標(biāo)為熒光RLU值繪制ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測的細(xì)胞，按照線粒體分離試劑盒的分離方法，提取細(xì)胞活性線粒體，根據(jù)測得的熒光RLU值，按ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線對其進行定量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用±s表示。兩均數(shù)比較用t檢驗，多組均數(shù)比較采用One-way ANOVA檢驗。

2 結(jié)果

2.1AngⅡ抑制乳鼠心肌細(xì)胞線粒體ATP的生成原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞給予AngⅡ處理12、24、36或48 h后，分別提取活細(xì)胞線粒體并測定ATP濃度，觀察AngⅡ?qū)€粒體能量生成的影響。100 nmol·L-1AngⅡ刺激心肌細(xì)胞12、24 h后，線粒體ATP濃度均未發(fā)生改變。刺激36 h后，線粒體ATP的水平較對照組明顯下降(P＜0.01)，刺激48 h后ATP含量有進一步下降的趨勢(P＜0.01)(Fig 1B)。未給予AngⅡ處理的心肌細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)12、24、36或48 h，線粒體ATP的濃度均未發(fā)生改變(Fig 1A)。以上結(jié)果表明，100 nmol·L-1AngⅡ能明顯抑制心肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生ATP，且ATP含量的變化呈時間依賴性下降。

2.2AngⅡ誘導(dǎo)RIP140基因表達同時抑制PGC-1α基因表達RIP140與PGC-1α是調(diào)控線粒體產(chǎn)能的重要輔助因子，兩者在心肌細(xì)胞中均有表達，有共同的下游靶基因，但執(zhí)行相反的轉(zhuǎn)錄功能。兩者通過與核受體或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(比如PPARs、ERRs、NRFs家族等)，調(diào)控脂肪酸、葡萄糖代謝過程中相關(guān)酶的表達，在維持線粒體能量平衡中扮演重要角色。為進一步明確AngⅡ介導(dǎo)的心肌產(chǎn)能下降是否與RIP140、PGC-1α相關(guān)，我們觀察了 AngⅡ?qū)IP140、PGC-1α基因的 mRNA、蛋白水平的影響。心肌細(xì)胞給予100 nmol·L-1AngⅡ處理36 h后，RIP140的mRNA水平明顯升高(P＜0.01)，而PGC-1α的水平明顯下降(P＜0.01)(Fig 2)。利用Western blot測定兩者的蛋白水平變化，發(fā)現(xiàn)AngⅡ處理組的RIP140蛋白水平較對照組升高了87%(P＜0.01)，而PGC-1α的水平則降低了54%(P＜0.01)(Fig 3)，RIP140、PGC-1α的蛋白變化與各自的mRNA水平變化一致。上述結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)RIP140表達升高的同時抑制PGC-1α的表達。

Fig 1 Changes of mitochondrial ATP contents in cardiomyocytes

2.3RIP140與PGC-1α基因介導(dǎo)AngⅡ?qū)€粒體ATP生成的影響為驗證RIP140與PGC-1α基因是否參與了AngⅡ?qū)π募∧芰看x的抑制作用，借助腺病毒系統(tǒng)，使乳鼠心肌細(xì)胞外源性過表達RIP140(腺病毒感染滴度MOI=100)或PGC-1α蛋白(腺病毒感染滴度MOI=100)，觀察各處理組線粒體ATP含量的變化。如Fig 4所示，與對照組相比，100 nmol·L-1AngⅡ刺激心肌細(xì)胞36 h后，線粒體ATP的含量下降40%(P＜0.01)。心肌細(xì)胞給予100 nmol·L-1AngⅡ處理的同時再過表達RIP140，線粒體ATP含量較僅給予AngⅡ處理組有進一步下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而給予AngⅡ處理同時過表達PGC-1α的心肌細(xì)胞，線粒體ATP含量較僅給予AngⅡ處理組相比明顯升高，但仍低于對照組水平(P＜0.05)。說明心肌細(xì)胞過表達RIP140促進AngⅡ介導(dǎo)的心肌線粒體產(chǎn)能進一步下降，過表達PGC-1α則減輕了AngⅡ?qū)π募【€粒體產(chǎn)能的抑制作用。RIP140與PGC-1α共同參與了AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞線粒體產(chǎn)能的影響。

Fig 2 mRNA levels of RIP140 and PGC-1α after AngⅡ treatment

Fig 3 Protein levels of RIP140 and PGC-1α after AngⅡ treatment

3 討論

RIP140與PGC-1α是調(diào)控機體能量貯存和利用、線粒體生成的重要的轉(zhuǎn)錄輔抑制因子和轉(zhuǎn)錄輔激活因子［3］。二者在調(diào)控心臟能量代謝平衡，維持心臟正常的形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要的作用。PGC-1α作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子，促進核受體/轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及線粒體生成，可以激活與脂肪酸的攝取、氧化和氧化磷酸化緊密相關(guān)的多種代謝基因，被認(rèn)為是糾正衰竭心臟能量紊亂的新靶點［4］。心肌細(xì)胞過表達 PGC-1α，可誘導(dǎo)與脂肪酸轉(zhuǎn)運、利用及β氧化過程密切相關(guān)基因的表達，同時線粒體的耗氧速率也明顯增加［5］。受體相互作用蛋白RIP140為轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，與PGC-1α的功能恰恰相反，能明顯抑制脂肪［6］、骨骼?。?］、心臟［8-9］等代謝組織的分解代謝。其與核受體結(jié)合后能夠負(fù)向調(diào)節(jié)多種代謝組織中靶基因的轉(zhuǎn)錄。RIP140與PGC-1α表達的失衡可能是導(dǎo)致心肌能量代謝紊亂，進而加劇心力衰竭病程的重要因素。

Fig 4 Change of ATP contents in AngⅡtreated cardiomyocytes after overexpressing RIP140 or PGC-1α

本研究發(fā)現(xiàn)RIP140與PGC-1α在AngⅡ抑制心肌產(chǎn)能過程中扮演重要角色。AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞線粒體生成ATP的能力下降，促進轉(zhuǎn)錄輔抑制因子RIP140的表達，而抑制轉(zhuǎn)錄輔激活因子PGC-1α表達。借助腺病毒過表達載體，在AngⅡ處理的同時進一步過表達RIP140或PGC-1α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達RIP140后促進AngⅡ?qū)€粒體ATP的抑制作用，而過表達PGC-1α則能改善AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞線粒體產(chǎn)能的影響。說明AngⅡ?qū)TP生成的變化影響受RIP140和PGC-1α的共同調(diào)節(jié)，同時也進一步驗證了RIP140與PGC-1α在維持心肌能量代謝平衡調(diào)節(jié)上的作用是相反的。此外，本研究借助腺病毒載體外源性過表達RIP140和PGC-1α蛋白，克服了原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存在過表達效率低等問題，確保了研究結(jié)果的可信度。

心臟能量代謝是心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的研究熱點，糾正心肌能量代謝重構(gòu)有望成為開辟心力衰竭等疾病的治療的新向?qū)В?0，11］。筆者推測心臟能量代謝平衡的調(diào)控很可能取決于這些轉(zhuǎn)錄輔助因子的相對表達水平和活性，RIP140與PGC-1α表達的失衡很可能是心肌能量代謝紊亂的重要影響因素。但是，心肌能量代謝的過程是錯綜復(fù)雜的，多種核受體、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的代謝基因參與心肌能量代謝過程，該研究明確了 AngⅡ誘導(dǎo)RIP140表達升高與PGC-1α表達下調(diào)，從而影響線粒體ATP生成，這一發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)外尚無文獻報道。而對于AngⅡ在調(diào)控RIP140與PGC-1α表達變化后是通過何種核受體或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控還有待進一步深入研究。通過闡明RIP140和PGC-1α在AngⅡ介導(dǎo)心肌能量代謝影響的作用研究，將AngⅡ調(diào)節(jié)的RAS系統(tǒng)與心肌能量代謝紊亂聯(lián)系起來，這對了解高血壓、心肌肥厚等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機制具有重要的意義，為了解心肌能量代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展機制提供了理論依據(jù)，也為進一步找尋調(diào)控心肌能量代謝的靶點開拓了思路。

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