李 源 劉 穎 袁海峰 馬新欣 張 欣 李 明 侯吉星 權(quán)乾坤 李 璽

(西安電力中心醫(yī)院，陜西 西安 710032)

阿爾茨海默病(AD)病理改變主要包括老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元丟失等〔1～3〕。tau蛋白異常磷酸化是導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)發(fā)生的原因之一。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的含量會(huì)隨著年齡的增加而下降，而老年癡呆患者下降更為嚴(yán)重〔4〕。因此，膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性也反映了膽堿能神經(jīng)元的活性和AD的嚴(yán)重程度。人參皂苷Rg1是人參皂苷中最主要的成分之一，具有促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)可塑性、增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶力等作用〔5〕，提示Rg1對(duì)AD治療有著重要的潛在價(jià)值。但目前，關(guān)于人參皂苷Rg1對(duì)磷酸化tau(P-tau)蛋白及ChAT的影響國(guó)內(nèi)外均未見研究報(bào)道。本研究以岡田軟海綿酸(OA)誘導(dǎo)大鼠腦片tau蛋白過度磷酸化制備AD模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)P-tau蛋白、ChAT的表達(dá)的影響，旨在闡明人參皂苷Rg1抗癡呆的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠10只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，清潔級(jí)，鼠齡:5 w;體重:110～130 g;合格證號(hào)為SCXK(陜)2007-001。

1.2 藥品及試劑 人參皂苷Rg1，純度98.99%，吉林宏久生物科技股份有限公司產(chǎn)品;OA，純度98%，美國(guó)ALEXIS生物制劑公司產(chǎn)品;P-tau(Sere202)一抗ChAT一抗，辣根酶標(biāo)記二抗，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;PVDF膜及DAB染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 儀器 振動(dòng)切片機(jī)(上海之信儀器有限公司，型號(hào):ZQP-86);紫外分光光度儀(日本島津，型號(hào):UV-260);蛋白電泳儀(美國(guó)BIO-RAD，型號(hào):迷你型-3);凝膠成像圖像分析儀〔意大利 Segrate(Milan)〕。

1.4 方法

1.4.1 AD模型大鼠腦片模型的制備、分組及干預(yù) 將大鼠麻醉，快速斷頭，取出腦組織，行冠狀切片，取海馬及皮層腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養(yǎng)。整個(gè)過程持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5%CO2)，溫度始終保持低于4℃。每只大鼠平均取400μm厚海馬及皮層腦片5張，隨機(jī)分為五組:空白對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rg1高、中、低濃度組。各組腦片首先至于人工腦脊液中不做任何處理恢復(fù)1 h;然后Rg1高、中、低濃度組分別加入Rg1致使其終濃度為240、120、60μmol/L，培養(yǎng)至2 h;然后將OA加入模型組和人參皂苷R1各組中，致使其終濃度分別為1μmol/L，作用3 h，空白對(duì)照組不加任何處理。

1.4.2 Western印跡 干預(yù)結(jié)束后，將腦片取出勻漿，充分裂解后離心分離，定量分裝。采用不連續(xù)SDS-PAGE法，將提出的總蛋白經(jīng)電泳儀電泳在分離膠上展開、轉(zhuǎn)膜/印，經(jīng)多次封閉、漂洗后，用待測(cè)目的蛋白的一抗(P-tau抗體濃度200μg/ml、ChAT抗體濃度200μg/ml)與PVDF膜上的蛋白質(zhì)相互作用，再與辣根酶標(biāo)記的ChAT、P-tau第二抗體作用。采用DAB法顯色，用PBS做陰性對(duì)照。

1.4.3 圖像分析與檢測(cè) 通過二抗上的標(biāo)記酶與底物的反應(yīng)呈色，用凝膠成像分析儀對(duì)各組蛋白條帶表達(dá)情況進(jìn)行灰度值掃描分析，分別檢測(cè)各組P-tau、ChAT陽(yáng)性表達(dá)的情況，然后以各組條帶所測(cè)平均灰度值與β-actin的灰度值的比值，表示該組陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)量，采集10組數(shù)據(jù)，求均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用x±s表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析法及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片P-tau表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組P-tau表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1各濃度組P-tau表達(dá)均顯著減少(P＜0.01)，其中高濃度組P-tau表達(dá)減少最為明顯，其次為中、低濃度組。見表1、圖1。

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片ChAT表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組ChAT表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。人參皂苷Rg1各濃度組與模型組比較，ChAT表達(dá)均顯著增加(P＜0.01);高濃度組較中濃度組ChAT表達(dá)增加更為顯著(P＜0.01)，中濃度組較低濃度組表達(dá)增加(P＜0.01)。見表1、圖2。

表1 人參皂苷Rg1對(duì)AD大鼠腦片P-tau、ChAT表達(dá)的影響(x ± s，n=10)

圖1 各組大鼠腦片P-tau的表達(dá)

圖2 各組大鼠腦片ChAT的表達(dá)

3 討論

AD即老年性癡呆是以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能喪失為臨床特征的大腦退行性疾病。研究提示，Tau蛋白異常磷酸化在AD患者神經(jīng)變性和學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔6，7〕。OA是一種海洋生物提取物，研究證實(shí)，在體內(nèi)或體外條件下，OA可通過聯(lián)結(jié)催化亞單位以及甲基化抑制磷酸酯酶活性并引發(fā)tau蛋白異常的磷酸化這一AD關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔8〕，而tau蛋白異常磷酸化會(huì)使其結(jié)合組裝微管的生物學(xué)功能降低，進(jìn)而致微管解聚。由于微管在神經(jīng)細(xì)胞的軸漿運(yùn)輸、極性維持等生理活動(dòng)中具有重要作用，所以，tau蛋白過度磷酸化會(huì)嚴(yán)重阻礙細(xì)胞的正常生理功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退化，產(chǎn)生或加重AD病情〔9〕。AD患者腦中ChAT的活性反映了膽堿能神經(jīng)元的活性和病情的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OA處理的模型組大鼠ChAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量顯著減低。考慮這一機(jī)制可能正是由于OA使海馬及皮層神經(jīng)元中tau蛋白過度磷酸化，影響了啟動(dòng)微管組裝的微管蛋白-β亞單位與GTP結(jié)合的反應(yīng)，降低了微管組裝能力，損害了軸漿流，致使胞體和神經(jīng)末梢之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和遞質(zhì)的運(yùn)輸受到影響，使ChAT不能運(yùn)輸?shù)胶ｑR及皮層，導(dǎo)致AD模型大鼠腦片產(chǎn)生ChAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量顯著減低的變化，最終影響到海馬和皮層神經(jīng)元的形態(tài)和功能。

人參皂苷被認(rèn)為是人參的主要有效物質(zhì)，約占4%。根據(jù)皂苷元的不同，人參皂苷被分為原人參二醇類皂苷、原人參三醇類皂苷及齊墩果酸類皂苷。到目前為止，已分離鑒定出40余種人參皂苷單體。近年來，人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1等單體治療AD的研究已獲得一定的突破〔10〕，其中，人參皂苷Rg1的相關(guān)研究已經(jīng)顯示出對(duì)AD的預(yù)防和治療有一定的作用〔11，12〕。但其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)人參皂苷Rg1可以減少AD模型大鼠腦片P-tau的表達(dá)，同時(shí)增加膽堿能系統(tǒng)中乙酰膽堿的合成和釋放，增強(qiáng)腦突觸受體對(duì)膽堿的提取，提高大鼠ChAT的活性發(fā)揮抗AD的作用。并發(fā)現(xiàn)該作用具有明顯的劑量依賴性?？紤]其可能的機(jī)制是人參皂苷Rg1對(duì)抗了OA選擇性抑制蛋白磷酸酯酶這一作用，保持了蛋白激酶和磷酸酯酶的動(dòng)態(tài)平衡，使得tau蛋白異常磷酸化的數(shù)量減少，確保微管組裝能力不受損害，進(jìn)而保障了膽堿能系統(tǒng)中Ach的合成和釋放，維持腦中ChAT的正常水平。總之，人參皂苷Rg1可能通過抑制Tau蛋白磷酸化及促進(jìn)ChAT的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癡呆作用。

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