涂杜，徐志宏，張名位，張瑞芬，鄧媛元*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣州 510640;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室，廣州 510610)

腸黏膜屏障損傷是腫瘤患者化療過程中常見的并發(fā)癥［1］?；熕幬镉绕涫谴髣┝炕熕幬锟蓪ξ改c道造成損傷，引起惡心、嘔吐、腹瀉、食欲減退等一系列胃腸道癥狀，嚴(yán)重影響患者化療進程以及疾病預(yù)后［2－3］。為了評價機體在化療過程中由于腸黏膜損傷引起的代謝、營養(yǎng)、免疫等多方面的生理病理改變，為合理的營養(yǎng)膳食和藥物治療提供指導(dǎo)，建立合適的化療型腸黏膜損傷動物模型顯得尤為重要。

化療造成的腸黏膜炎動物模型的建立以前已有報道，其方法為一次性腹腔注射大劑量(20 mg/kg)MTX造成大鼠腸黏膜損傷。Mehmet等［4］研究發(fā)現(xiàn)20 mg/kg MTX可導(dǎo)致Wistar大鼠小腸黏膜損傷嚴(yán)重。該方法造成的腸黏膜損傷為急性損傷，持續(xù)時間一般為4～5d，之后逐漸恢復(fù)，也有部分動物在該過程中因損傷嚴(yán)重造成死亡。該模型展現(xiàn)了化療造成的腸黏膜損傷的典型發(fā)病特征，主要用于評價短期內(nèi)作用顯著的化學(xué)藥物或單一營養(yǎng)素的治療效果，但不適合中長期營養(yǎng)支持的整體效果評價?；熓情g歇性用藥的周期過程，在化療期間給予患者全面的腸內(nèi)營養(yǎng)支持不僅可以恢復(fù)腸道功能、維護腸黏膜屏障功能，對于加強機體免疫能力和促進康復(fù)也有積極作用。為了更好的模擬化療進程，評估中長期營養(yǎng)支持對化療造成的腸黏膜炎康復(fù)促進作用，本研究以SD大鼠(Sprague－Dawley rats)為實驗動物，建立一種大鼠持續(xù)性腸黏膜損傷模型，以達到損傷持續(xù)周期長、不會因用藥劑量過大造成動物死亡等效果，適用于研究化療造成的腸黏膜損傷對機體的生理病理影響和評價長期營養(yǎng)支持的整體應(yīng)用效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠100只，體重(200±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK(粵)2013－0020】提供，整個實驗過程均在標(biāo)準(zhǔn)的SPF級動物實驗室【SYCK(粵)2011－0116】中進行，室溫維持在22～25℃，濕度為(50±5)%，每籠5只，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，每天定量添加飼料1次(飼料為普通實驗鼠顆粒飼料，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，換水1次。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分為四組，開始實驗。

1.1.2 試劑

注射用氨甲喋呤購于山西普德藥業(yè)股份有限公司;D－乳酸標(biāo)準(zhǔn)品及 D－乳酸脫氫酶(D－LDH)、二胺氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品(DAO)均購于Sigma公司，尸胺二氫氯化物購于東京化成工業(yè)株式會社，鄰聯(lián)茴香胺、辣根過氧化物酶、氧化型輔酶I和肝素鈉均購于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，MPO、MDA試劑盒購于南京建成生物研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

高速/冷凍離心機(Thermo，美國)，－80℃低溫冰箱(Thermo，美國)，低速離心機(Thermo，美國)，酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)，紫外分光光度儀UV－1800(島津，日本)，差相熒光倒置顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腸黏膜炎模型的建立

采用MTX誘導(dǎo)腸黏膜損傷動物模型［6］。100只大鼠隨機分為空白組(control group)、模型組Ⅰ(MTX group I)、模型組Ⅱ(MTX group II)和模型組Ⅲ (MTX group III)，MTX group I 10只，其余每組各30只。第0天，MTX group I大鼠注射MTX(20 mg/kg);MTX group II和 MTX group III大鼠注射MTX(10 mg/kg)。在第6天，MTX group II大鼠再次注射10 mg/kg MTX;MTX group III大鼠再次注射5 mg/kg MTX。control group在第0天和第6天均注射等量的生理鹽水。MTX group I在第4天全部處死;其余每組于造模后第 4、5、6、10、11、12 天各處死5只大鼠，進行指標(biāo)分析。

1.2.2 標(biāo)本收集

乙醚麻醉大鼠后，將其仰臥固定于手術(shù)臺，沿腹部正中切口，首先心臟取血5 cm，置于裝有肝素鈉的離心管，離心分離血漿后－80℃保存待測。然后分離小腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，用冰生理鹽水沖洗凈，肉眼觀察大體形態(tài)并進行評分，同時取距回盲瓣5 cm處的3 cm回腸組織置于4%中性甲醛溶液固定，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)改變并評分，距10 cm處取5 cm小腸稱重，－80℃保存待測。

1.2.3 觀察指標(biāo)及測定方法

(1)體重和進食量記錄:實驗期間，每日上午9時喂食，并記錄大鼠體重，次日9時稱剩余飼料重，計算大鼠24 h進食量，攝食量=(飼料總量－飼料余量)/只數(shù)。

(2)形態(tài)學(xué)觀察、病理學(xué)分析及小腸組織損傷評分:將在甲醛中固定的小腸組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、酒精梯度脫水、蘇木素－伊紅(HE)染色、在光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。腸黏膜損傷程度按Chiu氏六級評分法［6］進行組織病理評分。其中采用盲法進行評分，評分人數(shù)為2人。

(3)D－乳酸測定:參照文獻［7］方法測定。

(4)DAO測定:參照文獻［8］方法測定。

(5)MPO測定:采用比色法測定，實驗步驟參照試劑盒說明書要求嚴(yán)格操作。

(6)MDA測定:采用硫代巴比妥酸(TBA)法，實驗步驟參照試劑盒說明書要求嚴(yán)格操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有結(jié)果均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較

采用Duncan法;兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠進食量和體重變化

如圖1和圖2所示，在實驗期間，空白組大鼠的進食量和體重正常，呈緩慢增加。MTX group I大鼠的進食量明顯下降，同時伴隨著體重的顯著降低。從第1天開始，MTX group II和MTX group III的進食量和體重逐漸下降，到第4天降到最低，從第5天開始兩組大鼠進食迅速恢復(fù)，體重也逐漸回升;第2次注射MTX后大鼠的進食量和體重變化與第1次相似，但程度均有減弱，且MTX group III第2次注射MTX后進食量和體重下降程度均低于MTX group II。由此可見MTX導(dǎo)致的腸黏膜損傷是一個急性損傷過程，病程較短，且隨著劑量增加，損傷程度加重。

2.2 大鼠小腸HE染色切片觀察

顯微鏡下觀察大鼠HE染色切片，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠小腸腸壁層次清晰，結(jié)構(gòu)完整，小腸絨毛排列緊密，如圖3A。MTX group I大鼠在第4天小腸黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫嚴(yán)重，毛細(xì)血管充血，小腸絨毛排列紊亂，高矮不一，大量倒伏、融合，絨毛尖端大量脫落，與固有層分離，隱窩形態(tài)和杯狀細(xì)胞缺失，炎癥細(xì)胞浸潤(圖3B)。MTX group II和 MTX group III大鼠(圖3C)小腸黏膜與MTX group I形態(tài)相似，但損傷程度稍輕，第5天絨毛排列比較整齊，部分絨毛脫落，與固有層分離，如圖3D;第6天大鼠小腸上皮結(jié)構(gòu)比較完整，只有部分絨毛高矮不一，基本恢復(fù)正常如圖3E。第10天MTX group II大鼠小腸黏膜形態(tài)出現(xiàn)小腸絨毛融合、腫大，固有層水腫等(圖3 F)，MTX group III大鼠小腸黏膜損傷程度小于MTX group II，僅部分絨毛脫落，間質(zhì)水腫(圖3 G)。第11、12天MTX group II大鼠開始慢慢好轉(zhuǎn)，小腸上皮結(jié)構(gòu)也較第10天完整(圖3 H，J)。MTX group III第11天已經(jīng)基本恢復(fù)正常(圖3 I)，第12天與空白組無明顯差異(圖3 K)。

圖1 實驗期間大鼠體重的變化Fig.1 Changes of body weight of the rats during the experiment

圖2 實驗期間大鼠進食量變化Fig.2 Changes of food intake of the rats during the experiment

2.4 大鼠小腸組織損傷程度評分

如表1所示，三個模型組Chiu評分在第4天達到最大，與空白組差異有顯著性(P＜0.05)。到第6天，MTX group II、MTX group III和空白組的 Chiu 評分差異仍有顯著性(P＜0.05);第2次注射MTX后，MTX group II和MTX group III Chiu評分在第10天達到最大，與空白組差異均有顯著性(P＜0.05)，且MTX group II顯著高于MTX group III(P＜0.05)，第11天開始兩模型組Chiu評分逐漸減小，但仍然顯著高于空白組(p＜0.05)，且MTX group II與MTX group III之間差異也有顯著性，MTX group II顯著高于 MTX group III(P＜0.05)，到第12天時，三組差異無顯著性。

注:圖中MTX group II和 MTX group III(day 4，5，6)(圖C、D、E)為該兩組中隨機抽取的大鼠小腸組織切片。圖3 大鼠小腸HE染色切片(×200)Note.Fig.C，D and E:Intestine samples randomly selected from the MTX groups II and III.Fig.3 Histology of the rat small intestine.HE staining，×200

2.5 大鼠血漿D-乳酸含量

D－乳酸是哺乳動物腸道內(nèi)固有細(xì)菌發(fā)酵代謝的終產(chǎn)物，血液中的D－乳酸基本上來源于腸道。當(dāng)腸黏膜屏障受損時，腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，通透性增加，同時局部細(xì)菌大量增殖，產(chǎn)生的D－乳酸即可通過受損腸黏膜經(jīng)循環(huán)入血，并在血中蓄積，使血漿D－乳酸水平快速升高。D－乳酸在外周血中水平可反映腸黏膜損害程度和通透性變化［9］。如圖4所示，在第4天，造模后的三組大鼠血漿中D－乳酸含量明顯高于空白組(P＜0.05)，說明20和10 mg/kg MTX均可以導(dǎo)致大鼠小腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷。第5天開始，MTX group II和MTX group III的D－乳酸含量逐漸下降，但第6天其含量仍顯著性高于空白組(P＜0.05)。第2次注射MTX后，第10天MTX group II和MTX group III的D－乳酸含量達到最大，與空白組均有顯著性差異(P＜0.05)，且MTX group II的D－乳酸含量顯著性高于MTX group III(P＜0.05)。到第12天，三組大鼠血漿中D－乳酸含量差異無顯著性。

表1 大鼠小腸組織損傷程度評分(n=5)Tab.1 The scores for small intestine tissue injury in the rats(Chiu scores)

圖4 大鼠血漿中D－乳酸含量的變化(n=5)Fig.4 Changes of D－lactate in the rat plasma(n=5)

2.6 大鼠血漿中DAO活力

DAO是哺乳動物小腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在腸黏膜絨毛受損時，由腸黏膜細(xì)胞釋放的 DAO大量地流入血液中，使其在血中濃度大幅上升，所以血液中DAO活性的高低反映了小腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性［10－11］。如圖5所示，在第4天，造模后的三組大鼠血漿中DAO活力明顯高于空白組(P＜0.05)。第5天開始，MTX group II和MTX group III活力逐漸下降，第6天MTX group II、MTX group III與空白組之間差異無顯著性(P＞0.05)。第2次注射MTX后，第10天MTX group II和MTX group III的DAO活力達到最大，與空白組比較差異均有顯著性(P＜0.05)，且MTX group II的DAO活力顯著性高于MTX group III(P＜0.05)。第12天MTX group II血漿中DAO活力仍顯著性高于空白組(P＜0.05)，而此時MTX group III和空白組之間差異無顯著性(P＞0.05)。

2.7 大鼠小腸組織MPO活力

研究表明，中性粒細(xì)胞是引起組織損傷，乃至多器官功能衰竭的關(guān)鍵細(xì)胞。它在腸道損傷后引起局部和全身炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用［12］。而MPO是中性粒細(xì)胞特有的酶，其活性大小與中性粒細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)，反映了腸組織損傷過程中中性粒細(xì)胞的浸潤程度［13］。如圖6所示，在第4天，造模后的三組大鼠小腸組織中MPO活性明顯高于空白組(P＜0.05)，第5天開始，MTX group II和 MTX group III MPO活力逐漸下降，但兩組與空白組之間仍差異有顯著性(P＜0.05)。第6天，三組間已無明顯差異(P＞0.05)。第2次注射 MTX后，第10天 MTX group II和MTX group III的MPO活力達到最大，其中MTX group III與空白組差異有顯著性(P＜0.05)。到第11天MTX group II中MPO活力仍顯著高于空白組(P＜0.05)。第12天三組之間MPO活力恢復(fù)到同一水平(P＞0.05)。

2.8 大鼠小腸組織MDA含量

腸黏膜炎癥過程中會產(chǎn)生大量的自由基(OFR)，這些OFR可以攻擊細(xì)胞各種成分，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)自由基和過氧化物，從而造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，功能代謝障礙［14］。小腸組織內(nèi)有著豐富的不飽和脂肪酸，最易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而造成損傷。穩(wěn)定性較高的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA的含量可以反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度［15］。如圖7所示，在第4天，造模后的三組大鼠小腸組織中MDA活性明顯高于空白組(P＜0.05)，第5天開始，MTX group II和MTX group III的MDA含量逐漸下降，但兩組與空白組之間仍有顯著性差異(P＜0.05)。第6天，三組間已無明顯差異(P＞0.05)。第2次注射MTX后，第10天MTX group II和MTX group III小腸組織中MDA含量達到最高，其中MTX group II與空白組有顯著性差異(P＜0.05)。到第11天MTX group II中MDA含量仍顯著高于空白組(P＜0.05)。第12天三組之間MDA含量恢復(fù)到同一水平(P＞0.05)。

圖5 大鼠血漿中DAO活力的變化(n=5)Fig.5 Changes of DAO in the rat plasma(n=5)

圖6 大鼠小腸組織中MPO活力的變化(n=5)Fig.6 Changes of MPO in the rat small intestine tissues(n=5)

3 討論

化療代謝藥物MTX引起腸黏膜損傷的作用機制主要是通過直接抑制小腸上皮細(xì)胞DNA的合成，從而導(dǎo)致腸隱窩細(xì)胞有絲分裂減弱和腸絨毛縮短，直至腸隱窩形態(tài)消失、絨毛皺縮脫落。本次實驗發(fā)現(xiàn)大鼠注射MTX后小腸黏膜下層間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血，隱窩消失，絨毛萎縮、融合，混合細(xì)胞浸潤，病理特征與Kolli等［16］研究結(jié)果相似。本次實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠注射MTX(20 mg/kg)后，大鼠腸黏膜膜損傷嚴(yán)重，體重、進食量下降，腹瀉嚴(yán)重，第4天發(fā)現(xiàn)有3只死亡。

圖7 大鼠小腸組織中MDA含量的變化(n=5)Fig.7 Changes of MDA in the rat small intestinal tissues(n=5)

本研究還發(fā)現(xiàn)，20和10 mg/kg的MTX均可導(dǎo)致大鼠腸黏膜損傷，造模后大鼠血漿中D－乳酸含量和DAO活力均顯著升高，且小腸組織中MPO活力和MDA含量升高，其在第4天達到最高，之后慢慢下降，在第6天就基本恢復(fù)正常。結(jié)合前人的研究結(jié)果和本實驗結(jié)果可知MTX引發(fā)的大鼠腸黏膜炎是一個急性損傷過程，整個周期只能維持4～5d。而Howarth等［17］的研究也證實MTX導(dǎo)致的腸黏膜損傷在第6或7天就基本可以恢復(fù)正常。由此可知單劑量注射MTX雖然展現(xiàn)了化療造成的腸黏膜炎的典型發(fā)病特征，但僅適用于評價短期內(nèi)作用顯著的化學(xué)藥物或單一營養(yǎng)素的治療效果，不適合中長期營養(yǎng)支持的整體效果評價。為了延長大鼠腸黏膜損傷時間，降低死亡率，本文試圖模擬臨床上腫瘤患者連續(xù)化療的方法，在損傷恢復(fù)后再次注射MTX，造成持續(xù)性腸黏膜損傷。由于20 mg/kg劑量較高，一次性注射后已經(jīng)造成30%的大鼠死亡，于是本文降低MTX劑量，并通過二次注射，造成大鼠腸黏膜二次損傷，由此整個損傷周期可以延長至12d。此外，研究發(fā)現(xiàn)在第2次注射MTX后大鼠癥狀與第一次相似，但損傷程度低于第1次，可能是連續(xù)二次注射，大鼠對MTX產(chǎn)生了耐藥性。同時我們還發(fā)現(xiàn)第2次以5 mg/kg MTX注射，大鼠腸黏膜損傷較輕微，修復(fù)較快，在第二次注射后3～4 d基本與正常組無差異。因此本研究采用間歇式兩次腹腔注射10 mg/kg MTX，造成腸黏膜持續(xù)損傷，由此成功建立腸黏膜持續(xù)損傷大鼠模型，其病理生理特征，與臨床研究結(jié)果基本吻合。此模型更加適合于非藥物型營養(yǎng)品的中長期治療評價，為臨床腸內(nèi)營養(yǎng)品治療腸黏膜損傷提供了評價平臺。

［1］Gibson RJ.Gut microbiome and intestinal mucositis:A new challenge for researchers［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(6):512－513.

［2］Sonis ST.Regimen－related gastrointestinal toxicities in cancer patients［J］.Curr Opin Support Palliat Care，2010，4:26 －30.

［3］Chipponi J，Huguier M，Pezet D，et al.Randomized trial of adjuvant chemotherapy after curative resection for gastric cancer［J］.Am J Surg，2004，187:440 －445.

［4］Mehmet Y，Ayhan E，Ahmet C.Effect of aged garlic extract against methotrexate－induced damage to the small intestine in rats［J］.Phytother Res，2006，20:504 －510.

［5］El－Boghdady NA.Protective effect of ellagic acid and pumpkin seed oil against methotrexate－induced small intestine damage in rats［J］.Ind J Biochem Biophys，2011，48(6):380 －387.

［6］Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in low－flow states:I.A morphological hemodynamic and metabolic reappraisal［J］.Arch Surg，1970，101(4):478 －483.

［7］Brandt RB，Siegel SA，Waters MG，et al.Spectrophotometric assay for D－(－ )－lactate in plasma ［J］.Anal Biochem，1980，102(1):39－46.

［8］黎君友，于燕.分光光度法測定血和小腸組織二胺氧化酶活性［J］.氨基酸和生物資源，1996，18(4):28－30.

［9］Rub J，Vogel F，Schrnidt E，et al.Effects of hydrogen peroxide scavenger catalase on villous microcirculation in the rat small intestine in a model of inflammation bowel disease［J］.Microvasc Res，2000， 59(3):329－337.

［10］Hosoda N，Nishi M，Nakagawa M，et al.Structural and functional alterations in the gut of parenterally or enterally fed rats［J］.J Surg Res，1989，47(2):129 －133.

［11］袁麗珍，董紅林.放射損傷后腸粘膜和血漿中二胺氧化酶活性的變化［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，1994，14(1):32－34.

［12］Chosay JG，Essani NA，Dunn CJ，et al.Neutrophil margination and extravasation in sinusoids and venules of liver during endotoxin－induced injury［J］.Am J Physiol，1997，5(272):195 －200.

［13］Masahiko S，Shinichi U，Kenji K，et al.A potential role of hyperbaric oxygen exposure through intestinal nuclear factor［J］.Crit CareMed，2004，32:1722－1729.

［14］Erdogan H，F(xiàn)adillioglu E，Yagmurca M，et al.Protein oxidation and lipid peroxidation after renal ischemia－reperfusion injury:protective effects of erdosteine and N－acetylcysteine ［J］.Urol Res，2006，34(1):41－46.

［15］金惠銘，王建枝.病理生理學(xué)［M］.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004，202－205.

［16］Kolli VK，Abraham P，Isaac B，et al.Preclinical efficacy of melatonin to reduce methotrexate－induced oxidative stress and small intestinal damage in rats［J］.Dig Dis Sci，2013，58(4):959 －969.

［17］Howarth GS，F(xiàn)rancis GL，Cool JC，et al.Milk growth factors enriched from cheese whey ameliorate intestinal damage by methotrexate when administered orally to rats［J］.J NUTR，1996，126(10):2519－2530.