呂金敏

蛇床子素誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯并引起凋亡性死亡研究

呂金敏

目的 探討蛇床子素（osthole）對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的殺傷作用及其機(jī)制。方法 將人肺癌細(xì)胞A549用不同濃度的蛇床子素治療后，采用MTT法檢測(cè)蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)DNA的含量測(cè)定蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞周期的影響、蛇床子素處理后A549細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)蛇床子素處理后A549細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p-Cdc2和Cyclin B1及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果 蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，50μM、100μM、150μM的蛇床子素組增殖抑制率分別為（25.4±3.2）%、（40.2±3.7）%、（63.7±4.5）%。蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)也呈劑量依賴性，50μM、100μM、150μM的蛇床子素組凋亡率分別為（9.4±1.4）%、（17.3±2.5）%、（22.9±3.3）%。蛇床子素處理后A549細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p-Cdc2、Cyclin B1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降，Bax表達(dá)顯著增高。結(jié)論 蛇床子素可誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯，并引起腫瘤細(xì)胞凋亡性死亡。

人肺腺癌細(xì)胞；A549；凋亡；細(xì)胞周期；蛇床子素

肺癌是危害人類健康的世界性難題，死亡率居惡性腫瘤首位，其中非小細(xì)胞性肺癌約占80%[1]，我國(guó)肺癌的5年存活率不足15%[2]。蛇床子素是從蛇床子中提取的活性物質(zhì)，中醫(yī)用于治療濕疹、皮膚瘙癢、陰道毛滴蟲感染、性功能障礙[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素還具有抗炎癥、抗肝炎以及抗腫瘤作用[4-6]，對(duì)于多種腫瘤均具有良好抑制作用。然而其對(duì)肺癌的抑制作用卻很少報(bào)道，且抗腫瘤作用的機(jī)制也不十分清楚。我們通過(guò)研究蛇床子素（osthole）對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的生物作用，發(fā)現(xiàn)蛇床子素可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡，將A549細(xì)胞阻滯于G2/M期并使之發(fā)生凋亡。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞來(lái)自于ATCC，培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自于Gibco公司，胎牛血清FBS購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司，蛇床子素（osthole）、二甲亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）、碘化丙啶（PI）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。PI和AnnexinⅤ凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó) ebioscience。βactin、Bcl－2、Bax、Cyclin B1、p－Cdc2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signal公司，PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.3 MTT試驗(yàn) 將A549細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，加入200μL含10%FBS的RPIM－1640培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并分別加入0、50、100、150μM的osthole培養(yǎng)24h及48h，之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL的DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率以以下公式計(jì)算：抑制率=（ODPBS－ODosthole）/ODPBS×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 在A549細(xì)胞中分別加入0、50、100、150μM的osthole培養(yǎng)48h，按照試劑說(shuō)明書將PI和annexin－V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞早期凋亡率用annexin－V單陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示，細(xì)胞凋亡性死亡率（晚期凋亡）用PI、annexin－V雙陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示。

1.5 細(xì)胞周期試驗(yàn) 在A549細(xì)胞中分別加入0、50、100、150μM的osthole培養(yǎng)48h，之后收集細(xì)胞用PBS洗2次，用70%乙醇在4℃固定過(guò)夜，之后用PBS清洗一次，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗處染色30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，G2/M阻滯用G2期細(xì)胞所占比率表示[7]。

1.6 Western blot試驗(yàn) 在A549細(xì)胞中分別加入0、50、100、150μM的osthole培養(yǎng)48h，然后取細(xì)胞裂解后做Western blot檢測(cè)Cyclin B1，p－Cdc2，Bcl－2和Bax的表達(dá)，目標(biāo)蛋白表達(dá)量由它們?cè)谀z片上顯色后的灰度與相應(yīng)β－actin的灰度比表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS11.0軟件進(jìn)行處理，P值計(jì)算采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的抑制作用A549細(xì)胞在不同濃度osthole的作用下相比于PBS對(duì)照組均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)，呈劑量依賴性,且用osthole處理48h較24h抑制作用顯著增加，提示osthole對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有時(shí)間依賴性。表明蛇床子素具有體外抗肺腫瘤作用，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度蛇床子素對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 不同濃度蛇床子素對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與0μM osthole組比較，*P＜0.01；與蛇床子素處理24h比較，△P＜0.01。osthole：蛇床子素

組別0μM osthole組50μM osthole組100μM osthole組150μM osthole組孔數(shù)3333濃度（μM）0 50 100 150 24h抑制率（%）0 25.4±3.2* 40.2±3.7* 63.7±4.5* 48h抑制率（%）0 36.7±3.0*△61.9±4.7*△83.4±5.9*△

2.2 蛇床子素誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549進(jìn)入G2/M阻滯 為了研究蛇床子素是否能誘導(dǎo)A549細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯，我們用各種濃度osthole處理A549 48h并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，我們發(fā)現(xiàn)隨著osthole劑量的增加，進(jìn)入G2/M阻滯的A549顯著增加，見(jiàn)表2。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)Cyclin B1和p－Cdc2是腫瘤細(xì)胞完成細(xì)胞周期的關(guān)鍵點(diǎn)，一些抗腫瘤藥物通過(guò)下調(diào)Cyclin B1和p－Cdc2的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G2/ M阻滯，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[8－9]。因此為了進(jìn)一步在蛋白水平研究osthole對(duì)A549細(xì)胞周期的影響，我們用Western blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1、p－Cdc2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著osthole劑量的增加，Cyclin B1和p－Cdc2的表達(dá)下降，見(jiàn)表2。

2.3 蛇床子素誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡 隨著osthole劑量的增加，A549的早期凋亡率和凋亡性死亡率都顯著增加，150μM osthole組對(duì)A549凋亡性死亡率相比于0μM osthole組約提升8倍，見(jiàn)表3。Bcl－2蛋白家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，Bcl－2蛋白抑制凋亡，而Bax蛋白促進(jìn)凋亡[10]。隨著osthole劑量的增加，凋亡抑制蛋白Bcl－2表達(dá)下降而凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax表達(dá)升高，見(jiàn)表3。

表2 不同濃度蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)（±s）

表2 不同濃度蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)（±s）

注：與0μM osthole組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。osthole：蛇床子素。

組別0μM osthole組50μM osthole組100μM osthole組150μM osthole組孔數(shù)3333濃度（μM）0 50 100 150 G2/M阻滯（%）4.0±0.5 9.6±0.8* 17.3±1.7** 25.4±2.9**灰度比（Cyclin B1/β－actin）0.38±0.08 0.29±0.06* 0.23±0.05** 0.17±0.03**灰度比（p－Cdc2/β－actin）0.30±0.07 0.23±0.05** 0.16±0.03** 0.09±0.01**

表3 不同濃度蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用（±s）

表3 不同濃度蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用（±s）

注：與0μM osthole組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。osthole：蛇床子素。

組別0μM osthole組50μM osthole組100μM osthole組150μM osthole組孔數(shù)3333 osthole濃度（μM）0 50 100 150早期凋亡（%）3.4±0.4 12.2±1.8** 15.5±2.1** 19.7±2.8**凋亡性死亡（%）2.8±0.2 9.4±1.4** 17.3±2.5** 22.9±3.3**灰度比（Bcl－2/β－actin）0.33±0.06 0.28±0.05* 0.19±0.04** 0.10±0.02**灰度比（Bax/β－actin）0.29±0.03 0.44±0.06** 0.63±0.11** 0.83±0.12**

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及引起腫瘤細(xì)胞凋亡是天然藥物抗腫瘤活性的重要機(jī)制[11]。細(xì)胞周期阻滯能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖的抑制并會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，其中G2/M期的阻滯是藥物抗腫瘤機(jī)制的重要靶點(diǎn)，它能阻止DNA受損傷的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂并使之停留于G2期來(lái)修復(fù)自身的DNA[13]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)蛇床子素通過(guò)下調(diào)Cyclin B1和p－Cdc2的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的周期。凋亡是細(xì)胞自身的一個(gè)重要的生理過(guò)程，它能幫助機(jī)體清除受損傷的細(xì)胞，腫瘤發(fā)生的過(guò)程往往就是細(xì)胞凋亡失控的過(guò)程。凋亡過(guò)程受細(xì)胞內(nèi)多種因子的調(diào)節(jié)，其中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白就是Bcl－2蛋白家族，本研究顯示蛇床子素通過(guò)下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl－2的表達(dá)且增加凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax表達(dá)，誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549發(fā)生凋亡性死亡。研究提示蛇床子素可能在人肺癌治療中有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿：2014－07－16 修回：2014－08－04）

Osthole Induces G2/M Arrest and Apoptotic Cell Death in Human Lung Cancer Cells

LV Jin Min.Clini－cal Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To explore the effects of Osthole on the proliferation of A549 cells treated with Osthole and the underlying mechanism.Methods A549 cells were treated with various concentrations of Osthole.Cell proliferation was measured by using the MTT assay.Cell cycle was evaluated by using DNA flow cytometry analysis. Induction of apoptosis was determined by flow cytometry.The expressions of cell cycle related proteins Cyclin B1, p-Cdc2 and apoptosis related proteins Bcl-2,Bax were evaluated by Western blotting.Results Osthole significantly inhibited the proliferation of A549 cells in a dose-dependent manner.The inhibitory rate of A549 cells treated with 50,100,and 150μmol/L osthole were（25.4±3.2）%,（40.2±3.7）%,and（63.7±4.5）%,respectively.Osthole also increased the apoptosis of A549 cells in a dose-dependent manner.The apoptosis rate of A549 cells treated with 50,100,and 150μmol/L osthole were（9.4±1.4）%,（17.3±2.5）%,and（22.9±3.3）%,respectively.Western blotting showed that Osthole down-regulated the expressions of Cyclin B1,p-Cdc2 and Bcl-2 and up-regulated the expression of Bax in A549 cells.Conclusion Osthole can induce apoptotic cell death and G2/M arrest of A549 cells.

human lung adenocarcinoma cell；A549；apoptosis；cell cycle；osthole

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310005）