張光林，王旭東，占紅，蔣慧，陳曦

(黃石市中心醫(yī)院，湖北黃石435000)

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤，為全球第5位常見腫瘤，占癌癥死亡第2位［1］。目前發(fā)現(xiàn)肝癌為多蛋白、多基因參與、多步驟形成的疾病，但是其發(fā)病的具體分子機(jī)制仍不清楚。復(fù)制蛋白A(RPA)是真核細(xì)胞單鏈DNA(ssDNA)結(jié)合蛋白，在DNA代謝中RPA發(fā)揮重要作用，包括DNA復(fù)制、重組，以及 DNA損傷修復(fù)。RPA共由3個(gè)亞單位(RPA1、RPA2、RPA3)組成，每個(gè)亞單位都含有至少1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)。RPA1含有4個(gè)DBD結(jié)構(gòu)域，分別稱為 DBDA、DBDB、DBDC、DBDF。其中DBDA、DBDB的DNA結(jié)合活性最強(qiáng)［2］。研究證實(shí)，RPA在腫瘤組織中高表達(dá)，并且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)原發(fā)性肝癌與RPA相關(guān)研究的臨床報(bào)道。本文進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院肝膽外科及腫瘤外科2013年8月～2014年2月進(jìn)行手術(shù)治療的肝癌患者30例，男22例、女8例，年齡42～62歲、中位年齡51歲。術(shù)中在無菌條件下留取癌組織以及距離癌邊緣≥3 cm癌旁組織。用生理鹽水沖洗后置入準(zhǔn)備好的去RNA酶凍存管中，迅速將凍存管放入含冰塊的保溫桶內(nèi)保存。標(biāo)本于30 min內(nèi)送入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測RPA1 mRNA 利用總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司提供)完成總RNA提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生物化學(xué)公司合成cDNA，引物序列如下:RPA1:上游5＇-AAGTGGAGACCTACAACGAC-3＇;下游 5＇-ACAACCACCTGAGCGTAT-3＇;擴(kuò)增產(chǎn)物為 312 bp。β-actin:上游5＇-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3＇;下游 5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇;擴(kuò)增產(chǎn)物為 285 bp。以cDNA為模板，RPA1、β-actin兩種引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng);經(jīng)凝膠成像儀成像，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.2 Western blotting法檢測RPA1蛋白 取100 mg組織，提取蛋白，按照BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所提供)說明測定蛋白的含量，采用SDS-PAGE電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育;最后進(jìn)行顯色，取出條帶晾干，照相。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，測定目的條帶的灰度值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)比較 見表1、圖1、圖2。

2.2 RPA1表達(dá)與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2 和圖3、4。

3 討論

RPA在DNA延長和復(fù)制開始階段起著重要作用［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，RPA不僅參與DNA復(fù)制，而且參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程中出現(xiàn)異常事件，如DNA損傷或復(fù)制受阻時(shí)，細(xì)胞會很快啟動DNA損傷修復(fù)調(diào)控體系，及時(shí)中斷細(xì)胞周期的運(yùn)行，以提供足夠的時(shí)間修復(fù)損傷，保證細(xì)胞遺傳的穩(wěn)定性［5，6］。RPA 主要參與堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)和DNA錯(cuò)配修復(fù)。在核苷酸切除修復(fù)中，RPA 參與 DNA 損傷識別［7，8］，招募通用轉(zhuǎn)錄因子到達(dá)損傷部位。通用轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)亞基XPB和XPD打開損傷的DNA，XPA結(jié)合至損傷鏈，RPA結(jié)合至未損傷鏈以穩(wěn)定該開放狀態(tài)，然后由DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因和DNA修復(fù)基因F形成的異二聚體切除損傷DNA的5＇端，DNA修復(fù)基因XPG切除3＇端，去除包含損傷部位的寡核苷酸片段，隨后DNA聚合酶填充于該間隙，合成新的DNA，最后DNA連接酶補(bǔ)平缺口［9］。DNA雙鏈斷裂為最嚴(yán)重的損傷形式，RPA與雙鏈斷裂修復(fù)基因(Rad52、Rad51、Rad54)相互作用完成 DNA 修復(fù)，在此過程中，首先是 MRN復(fù)合物(Mre11/Rad50/Nbs1)切割雙鏈斷裂的DNA末端產(chǎn)生3＇末端。之后，Rad51與 RPA、Rad54、Rad52等結(jié)合在 DNA單鏈的3＇突出末端，促進(jìn)鏈交換在同源DNA間進(jìn)行，連接DNA鏈的斷裂并修復(fù)可能的缺失。

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)(±s)

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)(±s)

注:與癌旁組織比較，*P＜0.05

組織 n RPA1 mRNA RPA1蛋白肝癌組織 30 0.635±0.228* 0.876±0.205*癌旁組織30 0.448±0.186 0.727±0.153

圖1 RPA1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 RPA1蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

表2 RPA1表達(dá)與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 RPA1 mRNA在肝癌組織不同分期中的表達(dá)

圖4 RPA1蛋白在肝癌組織不同分期中的表達(dá)

肝癌發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞的異常生長需要DNA的大量復(fù)制及充足的修復(fù)能力。我們假設(shè)認(rèn)為，在肝癌DNA損傷修復(fù)過程中，由于RPA參與DNA的損傷修復(fù)，導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)，且隨著肝癌的進(jìn)展RPA的表達(dá)逐漸增多。本研究結(jié)果顯示，RPA1在30例肝癌組織中的表達(dá)與癌旁組織相比上調(diào)，與國內(nèi)外有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致，提示RPA1有可能參與了肝癌的形成。本研究結(jié)果還顯示，RPA1的表達(dá)上調(diào)與肝癌患者性別、年齡、乙肝感染、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓等無關(guān)，與肝癌患者的TNM分期呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明了RPA可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。但與國內(nèi)外有關(guān)研究有一定的差異，Levidou等［10］報(bào)道RPA1和RPA2在膀胱癌中高表達(dá)，但是隨著腫瘤的臨床分期升高其表達(dá)反而下降，其中RPA2對腫瘤的早期發(fā)展意義明顯，他們推斷RPA2可能與細(xì)胞周期蛋白D1協(xié)同推動早期膀胱癌的形成。原發(fā)性肝癌的發(fā)生是以多個(gè)抑癌基因失活和原癌基因激活為基礎(chǔ)的多階段多步驟過程。抑癌基因p53的突變失活將促進(jìn)肝癌的發(fā)生，是肝細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變的重要分子事件。近年相關(guān)研究證實(shí)，RPA(特別是RPA2)與p53基因相互作用，從而抑制野生型p53的活性，使受損的DNA在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)得到修復(fù)［11］。Givalos等［12］運(yùn)用免疫組化法檢測了RPA1、RPA2在130例結(jié)腸癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示RPA1、RPA2與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌組織中RPA1、RPA2表達(dá)越高的患者，生存時(shí)間越短;且RPA2的表達(dá)與腫瘤組織分級相關(guān)，他們推測正是RPA的過度表達(dá)抑制了p53抑癌基因的活性，從而使腫瘤更容易形成。Dahai等［13］檢測 RPA1和RPA2在食管癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示RPA1和RPA2在食管癌組織中的表達(dá)隨著臨床分期、組織分級的升高而升高，且RPA1表達(dá)越高的患者生存率越低。因此他們得出結(jié)論RPA可以作為預(yù)測食管癌惡性程度及臨床進(jìn)展的重要指標(biāo)。

綜上所述，RPA表達(dá)的增多可能與腫瘤的生長有密切關(guān)系。但是RPA在不同腫瘤中的不同階段作用可能存在差異，在不同腫瘤中RPA可能與不同的DNA修復(fù)基因相互作用，從而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到作用。在本實(shí)驗(yàn)中由于條件所限只研究了RPA1在肝癌中的半定量表達(dá)，RPA1與RPA2在肝癌形成中發(fā)揮著怎樣的不同作用，有什么共同聯(lián)系，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。由上述基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)可知RPA在DNA復(fù)制及修復(fù)中有重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)

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