史光軍，類成剛，陳增銀

(1青島市市立醫(yī)院，山東青島266001;2青島市城陽人民醫(yī)院)

HBx由HBV基因組編碼，具有多種調(diào)控功能，能激活多個與腫瘤侵襲相關的原癌基因及轉錄因子，是肝細胞癌發(fā)病的獨立危險因素［1～3］。2008年3月～2013年3月，我們利用脂質(zhì)體轉染法轉染人肝癌細胞系HepG2細胞，并用流式細胞儀、熒光顯微鏡觀察細胞增殖情況，探討HBx基因與肝癌細胞增殖的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞株HepG2細胞(購自中科院上海細胞庫)、脂質(zhì)體(購自長沙贏潤生物科技有限公司)、Annexin V-FITC(購自美國GeneCopoeia中國分公司)、SP試劑盒(購自福州邁新生物科技有限公司)、2%戊二醛(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司)，寡核苷酸引物根據(jù)HBx基因的序列自行設計引物(由長沙贏潤生物公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 重組X質(zhì)粒轉染HepG2細胞 HepG2細胞生長于含10%胎牛血清的MEM中，以脂質(zhì)體轉染的方法分別將重組X質(zhì)粒、未重組X質(zhì)粒轉染入HepG2細胞中，命名為轉染HBx細胞組、轉染空載體細胞組，另設未轉染HepG2細胞組，每組8例。具體步驟如下:選取對數(shù)生長期HepG2細胞，胰酶消化接種于直徑25 cm培養(yǎng)瓶，細胞數(shù)為1×106/L，6 h后細胞即可貼壁，繼而進行轉染。37℃預熱的無血清培養(yǎng)基加入 DNA 5 μg、Trans Fast Reagent 15 μL，立即渦旋混勻，室溫下靜置10～15 min。小心移出培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，稍渦旋混勻脂質(zhì)體/DNA混合物，輕輕加入培養(yǎng)瓶中，37℃孵育24 h，輕輕加入含血清的培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)4 mL，不必移去脂質(zhì)體/DNA混合物，37℃繼續(xù)孵育48 h。

1.2.2 流式細胞儀檢測HepG2細胞增殖活性 ①懸浮細胞離心(2 000 r/min離心5 min)，貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集。②用PBS洗滌細胞2次，調(diào)整待測細胞的濃度為5×105～1×106/mL;取1 mL細胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清。③加入1 mL冷的PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復步驟2次。④加入500 μL的 Binding Buffer懸浮細胞。⑤加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻;避光室溫反應15 min或4℃反應30 min。⑥室溫、避光反應5～15 min。⑦加入300 μL Binding Buffer，在 1 h 內(nèi)上機檢測。50 mL PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)過濾，4℃避光保存?zhèn)溆?。分別將轉染HBx細胞組、轉染空載體細胞組、未轉染HepG2細胞組細胞用含10%胎牛血清的MEM稀釋成1×104/mL，接種于6孔培養(yǎng)板。待細胞完全貼壁后，換為不含胎牛血清的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h:每孔加入 Annexin V-FITC 50 μL(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸掉培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，每孔加入75 μL DMSO，振蕩10 min，至結晶充分溶解。在492 nm波長下測定各孔的A值，代表各孔細胞增殖情況。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察各組細胞增殖比率 滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡，其步驟為:①將細胞于蓋玻片上生長，用適當?shù)牡蛲稣T導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組;②用PBS洗滌細胞兩次;③在500 μL 的 Binding Buffer中加入 2 μL Annexin VFITC、5 μL Propidium Iodide，混勻;④將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋;⑤避光、室溫反應5 min。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片觀察Annexin V-FITC熒光信號。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以百分比表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞一般情況 轉染HBx細胞組的HepG2細胞在37℃孵育72 h，生長較其他兩組的肝癌細胞密集。轉染空載體細胞組和未轉染HepG2細胞組的細胞未見異常增殖。PCR擴增結果提示，轉染HBx的HepG2細胞組中有X基因表達，表達的灰度值為0.926±0.105;而空載轉染組和未轉染HepG2細胞組中均未見有X基因的表達;三組間比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05))

2.2 各組流式細胞儀增殖分析及熒光顯微鏡圖像觀察情況 流式細胞儀增殖分析顯示，轉染HBx細胞組的HepG2細胞較多處于增殖期(G2期細胞占5.68%)(見圖1)。熒光顯微鏡圖像顯示，轉染HBx細胞組的HepG2細胞于37℃孵育72 h處于增殖期的細胞比率為47%，轉染空載體細胞組處于增殖期的細胞比率為28%，未轉染HepG2細胞組處于增殖期的細胞比率為25%。轉染HBx細胞組處于增殖期的細胞比率與其他兩組比較有統(tǒng)計學差異(P均＜0.05)。見圖2。

圖1 轉染HBx細胞組HepG2細胞流式增殖情況

圖2 熒光顯微鏡下各組細胞增殖比率

3 討論

HBV慢性感染是世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的主要發(fā)病原因之一，HBx基因致HCC發(fā)生的機制是目前研究的熱點。HBx基因存在于HBV基因的第4個閱讀框，為第1374～1838位核苷酸，長約465 bp。HBx基因在HBV中高度保守，其編碼的HBx蛋白分子量約為17 kD，具有強大的生物學功能，包括反式激活病毒基因組和宿主細胞基因的轉錄、增強轉錄因子DNA結合特性、抑制p53蛋白活性、抑制細胞DNA的修復、參與細胞信號傳導途徑和細胞凋亡的調(diào)節(jié)等。這些功能可能與HCC 的發(fā)生具有密切的關系［4，5］。Zhu 等［6］檢測 30例HCC患者，證實了HCC組織中存在HBx蛋白的表達;楊盛力等［7］對21例HCC采用免疫組化方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞組織中HBx呈彌漫性表達。一些體內(nèi)及體外研究也發(fā)現(xiàn)HBx可誘導細胞的惡性轉化甚至參與癌變發(fā)生［8，9］。因此，觀察HBx對體外細胞增殖的影響，可為進一步研究HBx致HCC的發(fā)生機制提供依據(jù)和線索。

本實驗以脂質(zhì)體轉染的方法成功將X基因轉染入HepG2細胞，并與轉染空載體細胞組和未轉染HepG2細胞組進行對照。發(fā)現(xiàn)轉染HBx細胞組較其他兩組的肝癌細胞密集，而轉染空載體細胞組和未轉染HepG2細胞組的細胞未見異常增殖。PCR擴增結果提示轉染HBx的HepG2細胞組中有X基因的表達，而空載轉染組和未轉染HepG2細胞組中均未見有X基因的表達。說明HBx具有促細胞增殖作用，可能參與肝細胞惡性轉化并促進其增殖。進一步用流式細胞儀分別檢測三組細胞增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)，轉染HBx細胞組的HepG2細胞較多處于增殖期。熒光顯微鏡圖像顯示轉染HBx細胞組的HepG2細胞處于增殖期的比率較其他兩組明顯升高。

HBx生物學效應十分復雜，有學者認為HBx主要通過反式激活機制調(diào)節(jié)細胞的增殖凋亡，參與調(diào)控細胞周期和細胞信號轉導途徑促進腫瘤發(fā)生［10］。隨著人們對HBxAg研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)X基因是高度保守的序列，但HCC卻常伴有X基因突變，HCC與HBx基因的持續(xù)表達有密切關系。突變發(fā)生于缺乏核酸錯配校正能力的病毒復制期或HBV整合和重排過程，突變X基因產(chǎn)生變異HBx。目前已能夠用一種顯色方法檢測突變HBx的轉活化功能，其轉活化能力升高或降低因突變類型而異。自然發(fā)生的X基因突變經(jīng)歷腫瘤細胞選擇，通過改變HBx的生物學功能，尤其是喪失誘導凋亡能力使肝細胞長期存活，在其他致癌因素作用下發(fā)生癌變［11，12］。X基因插入宿主DNA活化原癌基因或滅活抑癌基因中，是HCC啟動和演進的主要原因之一。X基因整合對人HCC發(fā)生的作用可能略有不同。約90%HBsAg陽性的HCC患者整合有HBV基因，整合部位多在DR1、DR2及兩者之間的黏性末端，因此 X基因大多保留且伴 3＇端截短。在mRNA檢測中發(fā)現(xiàn)，HCC選擇性表達X基因，而不表達S、C基因。推測細胞惡性轉化是由于X基因及其增強子促進下游EGFR基因轉錄活化高表達所致。Diamantis等［13］采用RT-PCR方法檢測了48例HCC組織中HBV基因在RNA水平的表達情況。其中，HBs基因表達者檢出2例，HBc基因檢出7例，而HBx基因檢出40例。從RNA和蛋白質(zhì)兩個水平上都有證據(jù)說明HBx基因的表達與HCC的發(fā)生有密切關系。

［1］Su Q，Schoder CH，WJ，et al.Expression of hepatitis B virus x protein in HBV-infected human livers and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，1998，27(4):1109-1120.

［2］Hoare J，Henkler F，Dowling JJ，et al.Subcellular localization of the X protein in HBV infected hepatocytes［J］.Med Viral，2001，64(4):419-426.

［3］李偉，劉傳苗，趙守松.原發(fā)性肝細胞癌患者肝組織中乙型肝炎病毒X基因的變異［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25(2):180-181.

［4］Arbuthnot P，Kew M.Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma［J］.Int J Exp Pathol，2001，82(2):77-100.

［5］Huang J，Deng Q，Wang Q，et al.Exome sequencing of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Nat Genet，2012，44(10):1117-1121.

［6］Zhu M，London WT，Duan B，et al.The value of hepatitis B X antigen as a prognostic marker in the development of hepatocellular carcinoma［J］.Int J Cancer，1993，55(4):571-576.

［7］楊盛力，張萬廣，陳孝平，等.Pin1在肝硬化和肝癌組織中的表達及其與乙型肝炎病毒X蛋白的關系［J］.腹部外科，2007，20(4):240-242.

［8］程斌，林松挺，楊玉珍，等.乙型肝炎病毒x影響肝細胞增殖與凋亡的初步研究［J］.臨床內(nèi)科雜志，2008，25(2):132-134.

［9］Chen L，Hu L，Li L，et al.Dysregulation of β-catenin by hepatitis B virus X protein in HBV-infected human hepatocellular carcinomas［J］.Front Med China，2010，4(4):399-411.

［10］李程，王永康，王昌源，等.乙型肝炎病毒X抗原表達與肝細胞凋亡的相關性［J］.中華肝臟病雜志，2013，21(4):252-256.

［11］王海平，陳孝平，何松清，等.調(diào)節(jié)胞內(nèi)HBx的表達對肝細胞凋亡的影響［J］.中華肝臟病雜志，2003，11(7):440.

［12］Toh ST，Jin Y，Liu L，et al.Deep sequencing of the hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma patients reveals enriched integration events，structural alterations and sequence variations［J］.Carcinogenesis，2013，34(4):787-798.

［13］Diamantis ID，McGandy CE，Chen TJ，et al.Hepatitis B X-gene expression in hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatology，1992，15(8):400-403.