彭 程，崔孟超，梁志剛，劉亭廷，張曉陽

（1.首都醫(yī)科大學 宣 武醫(yī)院，北京 100053；2.放射性藥物教育部重點實驗室 北 京師范大學 化 學學院，北京 100875）

阿爾茲海默癥（AD）是一種常見癡呆癥，Aβ斑塊是其重要病理學特征之一［1］，以之為靶點開發(fā)放射性分子探針，進而通過PET或SPECT核醫(yī)學顯像技術(shù)有可能實現(xiàn)對AD的早期診斷［2］。近年來已經(jīng)有多個用于PET顯像的Aβ斑塊分子探針得到美國FDA批準進入臨床應用，而用于SPECT顯像的Aβ斑塊分子探針的研發(fā)則滯后，至今只有［123I］I MPY進入過臨床實驗［3］。2005年，Nesterov等［4］報道了一個含有二噻吩結(jié)構(gòu)單元的小分子（NIAD-4）作為檢測Aβ斑塊的近紅外光學探針，隨后Nilsson等［5］報道了一系列多聚噻吩衍生物（LCPs）作為對蛋白質(zhì)構(gòu)象敏感的光學探針，這兩類探針不僅在體外與Aβ聚集體具有很高的親和力，而且能有效通過血腦屏障，與AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合。此后，崔孟超等［6－7］報道了兩類含有二噻吩結(jié)構(gòu)的 Aβ斑塊顯像劑，分別將二噻吩結(jié)構(gòu)單元與苯并噻唑和苯乙烯這兩類經(jīng)典的Aβ斑塊分子探針骨架結(jié)構(gòu)相連，并進行了125I放射性標記，體內(nèi)外生物評價均顯示優(yōu)良性質(zhì)。可見二噻吩結(jié)構(gòu)單元在與Aβ斑塊結(jié)合的過程中可能起著非常重要的作用。近年來，Ono等報道了一系列放射性標記的查爾酮（Chalcone）衍生物作為Aβ斑塊顯像劑，大多具有對Aβ聚集體較高的親和力，而且在正常小鼠腦內(nèi)具有較高的初始攝取，查爾酮成為一類新型的Aβ斑塊分子探針骨架結(jié)構(gòu)［8－10］。

本研究擬利用組合化學原理，將二噻吩結(jié)構(gòu)單元與查爾酮結(jié)構(gòu)連接，設(shè)計并合成兩個鹵代二噻吩查爾酮衍生物作為Aβ斑塊顯像劑，利用體外熒光染色實驗和競爭結(jié)合實驗評價其與Aβ聚集體的親和力，對碘代化合物進行125I放射性標記，并進行體外放射自顯影實驗和正常小鼠體內(nèi)分布實驗。

1 主要實驗材料

1.1 試劑和儀器

4－甲氧基苯乙酮：國藥集團化學試劑有限公司；化合物2，3參照文獻［6］制備；Na125I（2 200 Ci／mmol）：美國 Perkin-El mer公司；硫磺素-S：Sig ma-Al drich公司；Aβ1－42多肽：日本Osaka peptide institute（三氟乙酸鹽形式）；其他試劑均購自北京化工廠。

400 MHz核磁共振譜儀：Bruker AvanceⅢ；質(zhì)譜儀：Ther mo Surveyor MSQ Plus（EI）；SCL-10 AVP型高效液相色譜儀：配有Packard 500 TR型γ射線閃爍檢測器，島津；奧泰-626型高效液相色譜儀：配有LINEAR UVIS-201型紫外檢測器以及BIOSCAN型γ射線閃爍檢測器；Agilent TC-C18反相柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；Alltech C18反相柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；Axio Oberver Z1（Zeiss，Ger many）熒光顯微鏡，Per kin-El mer儲磷屏成像系統(tǒng)。

1.2 實驗動物

正常小鼠：ICR，5周，雄性，購自北京大學實驗動物中心。轉(zhuǎn)基因小鼠：C57BL6，APP-swe／PSEN1，12月齡，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。

2 實驗方法

2.1 穩(wěn)定化合物及標記前體的合成

合成路線及標記方法如圖1所示。

2.1.1 （E）-3-（5-［5′-溴-2，2′-二噻吩）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮 （化合物4）

稱取150 mg對甲氧基苯乙酮（化合物1，1.0 mmol）和273 mg溴代二噻吩醛（化合物2，1.0 mmol）溶于50 mL乙醇中，滴加50μL氫氧化鈉水溶液（1 mol／L）；室溫下攪拌30 min后有大量橙色固體析出；抽濾，并用20%乙醇水溶液洗滌三次，干燥后得到295 mg橙色化合物，產(chǎn)率為73%。

圖1 合成路線及標記方法Fig.1 Synthetic route and r adiolabeling method

2.1.2 （E）-3-（5-［5′-碘-2，2′-二噻吩］）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮（化合物5）

制備方法與化合物4類似，化合物1與化合物4反應，干燥后得到132 mg橙色化合物，產(chǎn)率為86%。

2.1.3 （E）-3-（5-［5′-三 丁 基 錫-2，2′-二 噻吩］）-1-（4-甲 氧 基 苯 基）-2-烯-1-丙 酮 （化 合物6）

將121 mg化合物4（0.3 mmol）、0.3 mL六正丁基二錫和35 mg四（三苯基磷）鈀（0.03 mmol）溶于10 mL甲苯中（含1 mL三乙胺）。110℃油浴中攪拌加熱反應10 h。減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）＝4∶1得到50 mg黃色蠟狀固體，產(chǎn)率為27%。

2.2 放射性標記及生物評價

2.2.1 ［125I］5的制備

稱取0.1 mg錫標記前體化合物6于安剖瓶中，加入100μL乙醇溶解，用微量進樣器加入約4μL［125I］NaI溶液（300μCi，比活度：542.7 TBq／g）。依次加入50μL H2O2（3%），100μL鹽酸（1 mol／L）。密閉后室溫下反應15 min后，加入50μL飽和亞硫酸氫鈉溶液終止反應，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)p H至中性。乙酸乙酯萃?。?×1 mL）分液，有機相用氮氣吹干，殘余物用100μL乙醇溶解后進HPLC分離，分離條件為：Alltech C18 analytical col u mn（4.6 mm×250 mm）；CH3CN／H2O＝9／1；流速1.0 mL／min。

收集含有目標物的流出液，旋蒸除去溶劑，將得到的標記配體溶于少量乙醇并用生理鹽水配制成所需要的濃度置于－20℃中存儲待用。最后通過HPLC分析125I標記配體與參比化合物的保留時間。［125I］5的分析條件如下：Agilent TC-C18 analytical colu mn（4.6 mm×150 mm）；V（CH3CN）∶V（H2O）＝9∶1；流速1.0 mL／min。

2.2.2 體外熒光染色

轉(zhuǎn)基因小鼠及正常小鼠大腦石蠟切片（8μm）依次經(jīng)過3×20 min的二甲苯脫蠟，2×5 min 100%乙醇，2×5 min 95%乙醇，5 min 80%乙醇和5 min 70%乙醇洗滌，流水沖洗10 min后，浸于化合物4或5（1μmol／L，20%乙醇）溶液中10 min，切片經(jīng)過50%乙醇洗滌2 min、去離子水洗滌2 min后，采用熒光微鏡觀察，使用GFP濾鏡。硫磺素-S對照染色與上述方法相同，使用質(zhì)量分數(shù)為0.125%的硫磺素-S水溶液。

2.2.3 體外放射自顯影

轉(zhuǎn)基因小鼠腦石蠟切片及對照正常小鼠腦石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，滴加純化后的［125I］5溶液（約370 k Bq／100μL），室溫下孵育60 min。用40%的乙醇溶液沖洗切片3 min，干燥后在磷屏上曝光6 h后進行成像分析。同一切片經(jīng)過硫磺素-S染色后與放射自顯影實驗結(jié)果進行對照。

2.2.4 體外競爭結(jié)合實驗

硅烷玻璃試管中依次加入放射配基（［125I］TZDM，100 000 min－1／100μL，10%乙醇），化合物4或5溶液（終濃度范圍：10－4～10－11mol／L），Aβ1－42聚集體（終濃度：28 n mol／L），用PBS（含10%乙醇）定容至1 mL；37℃水浴中震蕩孵育2 h；細胞收集器分離結(jié)合復合物與游離放射配基（GF／B濾紙用0.5%PEI浸泡2 h）；Wizard 1470型伽瑪計數(shù)儀測定濾膜上放射性計數(shù)；利用Graph Pad Pris m 4.0分析數(shù)據(jù)得到半抑制常數(shù)IC50；根據(jù)Cheng-Prusoff方程計算抑制常數(shù)Ki＝IC50／（1＋［L］／Kd）［11］。

2.2.5 正常小鼠體內(nèi)生物分布

將5μCi純化后的［125I］5（100μL生理鹽水，含10%乙醇）由尾靜脈注射入四組正常ICR小鼠體內(nèi)（n＝5），分別于2、30、60、120 min斷頭處死，解剖取出其臟器，測量臟器濕重及放射性計數(shù)，計算其放射性百分計量（%ID／organ）及每克臟器中的放射性攝取率（%ID／g）。

3 結(jié)果與討論

3.1 穩(wěn)定化合物及標記前體的合成

合成的化合物均經(jīng)過核磁共振（1H NMR）與質(zhì)譜（EI-MS）的表征。

（1）化合物4的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.8 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.30（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.5 Hz，1H），7.08（d，J＝3.7 Hz，1H），7.03－6.95（m，4 H），3.89（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13Br O2S2403.95；f ound 404.13。

（2）化合物5的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.9 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.4 Hz，1 H），7.29（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.8 Hz，1 H），7.19（d，J＝3.8 Hz，1 H），6.98（d，J＝8.9 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.8 Hz，1 H），3.90（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13IO2S2451.94；f ound 452.04。

（3）化合物6的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.40（d，J＝7.9 Hz，2 H），7.21（d，J＝5.0 Hz，1 H），7.18（d，J＝2.7 Hz，1 H），7.07（s，1 H），7.04（d，J＝15.4 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.7 Hz，1 H），6.89（d，J＝8.0 Hz，2 H），6.85（d，J＝15.2 Hz，1 H），3.83（s，3 H），1.73－1.58（m，6 H），1.41－1.28（m，6 H），1.06－1.20（m，6 H），0.92（t，J＝7.3 Hz，9 H）.MS（EI）：m／z calcd for C30H40O2S2Sn 616.15；found 616.53。

3.2 ［125I］5的制備

經(jīng)過錫－鹵交換法成功進行了125I標記，標記率大于99%，通過HPLC分離純化去除標記前體及無機鹽等雜質(zhì)后得到［125I］5，經(jīng)HPLC分析其放化純度大于99%。［125I］5與穩(wěn)定化合物5在相同條件下進行HPLC共進樣分析，二者保留時間分別為4.28 min和4.80 min，能夠很好地匹配，［125I］5的結(jié)構(gòu)得到認證。

3.3 體外熒光染色

所合成化合物4和5均能清晰地標記出轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上Aβ斑塊的位置，而且可以與相鄰切片經(jīng)硫磺素-S染色的結(jié)果對應（見圖2），表明兩個化合物與Aβ斑塊均有較好的親和力和選擇性。

圖2 化合物4（a）和5（c）在轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上的熒光染色結(jié)果t he adjacent sections were stained wit h t hio avin-S（b，d）.（10×magnification）Fig.2 Fluorescence staining of 4（a）and 5（c）on brain sections from Tg mouse

3.4 體外競爭結(jié)合實驗

以［125I］TZDM為放射性配基進行的體外競爭結(jié)合實驗表明，合成的化合物4和5均能對［125I］TZDM 與 Aβ1－42聚集體的結(jié)合產(chǎn)生顯著的抑制作用（見圖3），經(jīng)過定量計算得到化合物4和5的Ki值分別為2.33 n mol／L和0.88 n mol／L，表明兩個化合物對 Aβ1－42聚集體均有很高的親和力，且碘代化合物5比溴代化合物4的親和力更高，因此，選擇化合物5進行進一步的125I標記和生物評價。

3.5 體外放射自顯影

標記化合物［125I］5在轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上有明顯的放射性濃集（圖4），而同齡正常小鼠腦切片上無放射性濃集，表明該化合物能與轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊進行特異性結(jié)合，且自顯影結(jié)果能與相同切片經(jīng)硫磺素-S染色結(jié)果相對應，表明［125I］5與Aβ斑塊具有較高的親和力和選擇性。

3.6 正常小鼠體內(nèi)生物分布

［125I］5在正常ICR小鼠體內(nèi)的分布如表1所示，標記化合物在小鼠腦內(nèi)的2 min初始攝取為（1.19±0.09）%ID／g，到30 min時即清除至（0.36±0.09）%ID／g，可見其初始腦攝取不是很高，但清除速率較快（2 min與30 min腦攝取比值為3.3）。此外，［125I］5在肝臟中有較高的初始攝取和顯著的代謝。

圖3 化合物4和5對［125I］TZDM與Aβ1－42聚集體結(jié)合的抑制曲線Fig.3 Inhibition curves for the binding of［125I］TZDM to Aβ1－42 aggregates

圖4 放射性自顯影a——［125I］5；b——t hioflavin-S；c——wild-type mouseFig.4 In vitro autoradiography studies of［125I］5 on brain sections

表1 ［125I］5在正常小鼠體內(nèi)的生物分布（ˉx＋s，n＝5）Table 1 Biodistribution in nor mal mice after i.v.injection of［125I］5（ˉx＋s，n＝5）

3 結(jié)論

本研究成功制備了兩個鹵代二噻吩查爾酮類Aβ斑塊分子探針，體外熒光染色實驗和體外競爭結(jié)合試驗均證實與Aβ1－42聚集體有很高的親和力。通過錫－鹵交換法成功對碘代化合物5進行了125I標記，體外放射自顯影實驗顯示［125I］5能夠特異性地標記AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦Aβ斑塊，并與硫磺素-S的染色結(jié)果對應。正常小鼠生物分布結(jié)果表明，［125I］5穿過血腦屏障的能力較弱，2 min時的腦放射性攝取率為1.19%ID／g，與［125I］I MPY相比（2 min腦攝取值為2.88%ID／g）還有很大差距，但腦清除速率較快。綜上所述，［125I］5具有成為Aβ斑塊顯像劑潛力，但需要進一步結(jié)構(gòu)修飾以提高初始腦攝取。

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