刁 堯，廖琳丹，王 姝，姜玉艷，張大龍，任 鵬，段弘燁，孟洪顏，劉 博，石文彬，閻 英，李亞明

（1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 核 醫(yī)學科，遼寧 沈 陽 110001；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院PET／CT中心，黑龍江 齊 齊哈爾 161000；3.沈陽市蘇家屯中心醫(yī)院 核 醫(yī)學科，遼寧 沈 陽 110100；4.山東麥德盈華科技有限公司，山東 濟 寧 276000；5.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 放 療科，遼寧 沈 陽 110016）

毒死蜱（Chlor pyrif os，CPF），化學名稱為0，0-二乙基-0-（3、5、6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，分子式為C9H11C13NO3PS，相對分子質(zhì)量為350.6，是目前全球使用廣泛的一種有機磷酸醋類農(nóng)藥，既是殺蟲劑又是除草劑，常溫下毒死蜱為白色結(jié)晶固體，溶點為42.5～43℃。文獻報道［1－3］毒死蜱具有觸殺、胃毒和熏蒸三重作用，可以通過對乙酰膽堿酯酶（Acetylcholine esterase，ACh E）的抑制引起接觸者中毒。雖然毒死蜱的藥效涉及很多方面，但其在生物體內(nèi)的具體代謝和分布行為的報道較少，到目前為止，尚未見到用放射性核素標記毒死蜱并觀察其生物分布及代謝的文獻報道，這妨礙了對毒死蜱相關(guān)藥效的深入研究。本研究擬采用靈敏的放射性示蹤法分析毒死蜱在小鼠體內(nèi)的分布特點，以揭示其主要的代謝方式。該方法的建立有助于有機磷農(nóng)藥殘留檢測以及毒死蜱代謝機制研究，同時對于保證食品安全、維護人類健康具有重要的研究價值和應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CPF：Sigma公司（99.9%，HPLC）；Na131I：中國原子能科學研究院；Iodogen：Sig ma公司；K M 小鼠（SYXK（遼）2008-0005）：中國醫(yī)科大學實驗動物中心；γ－計數(shù)儀（FJ-2008PS）：西安核儀器廠；磷屏成像儀 PMI 170-9400：Bio-Rad，美國；聚酰胺薄膜：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 131I-CPF制備

毒死蜱（CPE）結(jié)構(gòu)式示于圖1。采用Iodogen法對CPF進行131I標記。標記管中預先涂以Iodogen 50μg，向標記管中依次加入50μL的CPF樣品（1 mg／mL，DMSO（二甲基亞砜）溶解），10μL 18.5 MBq Na131I，振蕩反應10 min，以生理鹽水溶解，放置備用。以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)，以生理鹽水為第一展開劑，乙酸乙酯和石油醚（體積比2∶1）為第二展開劑，測定其標記率、放化純度和比活度。

圖1 Chlorpyrifos的分子結(jié)構(gòu)式（＊ 為131I可能標記位點）Fig.1 Chemical structure of Chlorpyrifos（＊labeling site）

1.3 131I-CPF放化純度的鑒定

采用薄層層析法，吸取碘化反應液2μL，在距聚酰胺薄膜薄層層析板底端1 c m處點樣，游離131I－作為對照點樣，點樣直徑0.2 c m，冷風吹干。生理鹽水為第一展開劑，上行展開，磷屏成像儀成像；乙酸乙酯和石油醚（體積比2∶1）為第二展開劑，上行展開，磷屏成像儀成像。成像結(jié)束后分段剪取聚酰胺層析板，經(jīng)γ放免計數(shù)儀測量放射性計數(shù)，計算標記率、放化純度、放射性比活度和放射性濃度。

標記物的標記率（%）＝（131I-CPF的計數(shù)率／點樣量總計數(shù)率）×100；比活度（TBq／g）＝（放射性核素投入量×標記率）／投入的放射性總量；放射性濃度（GBq／L）＝（放射性核素投入量×標記率）／標記反應總體積。

1.4 131I-CPF的純化

采用薄層層析法，聚酰胺薄膜薄層層析板，6 c m×20 c m，距底邊1.5 c m處鉛筆畫線設為原點，點樣直徑為0.2 c m，冷風吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開。晾干，磷屏成像儀成像，根據(jù)已知的Rf值，在原點處刮下聚酰胺粉末（吸附有131I-CPF）置于清潔玻璃小瓶中，DMSO溶解，反復多次，真空泵吹干標記物附著于管壁，DMSO助溶，取2μL進行薄層層析，鑒定放化純度，純化后的標記物的放化純度（%）＝（131I-CPF的計數(shù)率／點樣量的總計數(shù)率）×100。

1.5 131I-CPF體外穩(wěn)定性

取50μL純化后的標記物分別加入到100μL生理鹽水和新鮮人血清。在37℃下貯存，分別于2、24、48 h取樣，聚酰胺薄膜層析測定放化純度，觀察標記物的穩(wěn)定性。

1.6 131I-CPF的小鼠體內(nèi)分布

35只K M小鼠（約20 g，4周齡，雄性）隨機分為7組（n＝5），各組每只鼠經(jīng)尾靜脈注射200μL131I-CPF（約185 k Bq／只），各組小鼠分別于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、胃、腸、睪丸、腦、脊髓、甲狀腺、頜下腺、血，稱重，測各個樣品放射性計數(shù)，計算每克組織攝取放射性占注入量的百分率（%ID／g）。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 131I-CPF的標記率及放化純度

在以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)、生理鹽水為展開劑的體系中，131I-CPF的Rf值為0～0.1，游離的 Na131I的Rf為0.4～0.5；在乙酸乙酯和石油醚（2∶1）為展開劑的體系中，131I-CPF的Rf為0.9～1.0，游離的 Na131I的Rf為0～0.1。經(jīng)測定，兩種體系條件下131I-CPF的標記率均為93.5%，放化純度為96.9%，放射性濃度90.24 GBq／L及比活度0.35 TBq／g。

2.2 131I-CPF的體外穩(wěn)定性

131I-CPF在不同體系中、37℃溫度下的穩(wěn)定性結(jié)果示于圖2，由圖2可見，標記物分別在人血清和生理鹽水體系中，37℃下放置48 h，標記物的放化純度仍大于90%，表明標記物在37℃環(huán)境下體外穩(wěn)定性較好。131I的標記位點分析，131I可能標記在吡啶環(huán)上，即I取代 H（＊ 為可能標記位點，圖1）。

圖2 131I-Chlorpyrifos的體外穩(wěn)定性Fig.2 Stability of 131I-Chlor pyrifos in vitr o

131I-CPF薄層層析后磷屏成像分布示意圖示于圖3。

2.3 131I-CPF在小鼠體內(nèi)生物分布

動物實驗結(jié)果列于表1。由表1顯示，靜脈注射給藥后131I-CPF在體內(nèi)分布廣泛。血和腎中清除較快，注射后5 min時即達峰值，其放射性攝取率分別為37.27%ID／g和8.50%ID／g；心、肝、脾、肺、小腸、大腸、肌肉和頜下腺中分布均較高，注射后10 min時即達峰值，其放射性攝取率分別為10.86、6.32、7.97、37.12、8.12、8.15、7.04和7.02%ID／g，而后逐漸下降，表明131I-CPF在體內(nèi)主要經(jīng)肺、肝、脾、腸道和頜下腺代謝；131I-CPF在腦、脊髓和睪丸中亦有一定分布，注射后10 min時其放射性攝取率分別為4.25、3.41和4.62%ID／g；甲狀腺內(nèi)的放射性隨時間的延長而逐漸增加，注射后5 min和24 h其放射性攝取率分別為12.99%ID／g和162.21%ID／g。

圖3 131I-Chlor pyrifos薄層層析示意圖Fig.3 Chr omatograms of 131I-Chlor pyrifos

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠體內(nèi)的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠體內(nèi)的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

組織8.29±0.85 10.86±1.12 2.51±0.18 2.88±0.23 0.64±0.05 0.21±0.02 0.11±0.02肝4.34±3.42 6.32±1.84 2.48±0.27 1.99±0.21 1.25±0.02 0.22±0.04 0.10±0.01脾5.73±0.62 7.94±1.94 2.05±0.31 2.25±0.22 0.54±0.06 0.15±0.01 0.03±0.01肺20.11±3.74 37.12±3.85 6.81±0.81 4.33±0.47 2.35±0.15 1.16±0.13 0.04±0.01腎8.50±3.65 4.58±1.87 4.35±1.17 2.61±0.82 1.48±0.12 0.69±0.01 0.13±0.01胃3.81±0.34 6.18±0.84 5.41±0.57 2.86±0.14 1.55±0.13 0.26±0.02 0.11±0.01小腸 6.09±0.87 8.12±0.95 3.41±0.35 5.45±0.63 1.38±0.12 0.34±0.05 0.05±0.01大腸 5.25±0.42 8.15±0.75 3.34±0.44 2.07±0.24 0.44±0.05 0.13±0.03 0.02±0.01骨2.02±0.32 2.94±0.35 2.04±0.31 1.48±0.18 0.32±0.02 0.09±0.01 0.02±0.01肌6.18±0.95 7.04±1.11 4.48±0.55 3.23±0.43 1.13±0.19 0.61±0.05 0.03±0.01血37.27±4.77 23.76±4.46 13.45±2.55 9.51±2.12 4.17±0.66 1.35±0.18 0.56±0.03腦2.05±0.49 4.25±0.53 3.79±0.42 1.38±0.08 0.52±0.02 0.32±0.01 0.01±0.01脊髓 1.85±0.21 3.41±0.23 2.65±0.16 1.17±0.11 0.32±0.02 0.22±0.01 0.01±0.01頜下腺 4.72±1.23 7.02±2.81 3.92±0.51 2.96±0.64 0.56±0.04 0.14±0.01 0.02±0.01睪丸 1.32±0.12 4.57±0.94 3.12±0.22 1.47±0.13 0.24±0.02 0.11±0.01 0.03±0.01甲狀腺 12.99±4.45 14.58±3.26 22.22±4.58 32.98±5.6不同時間（min）各組織的放射性攝取率／（%ID·g－1）5 10 30 60 120 240 1 440心6 77.21±9.54 132.36±18.65 163.65±23.54

3 討論

機體內(nèi)與有機磷農(nóng)藥代謝密切相關(guān)的膽堿酯酶有乙酰膽堿酯酶（ACh E）、丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，Bu Ch E，又稱假性膽堿酯酶）和羧酸酯酶（Car boxylesterase）等，其中ACh E又稱真性膽堿酯酶，主要作用于乙酰膽堿，ACh E主要分布于神經(jīng)肌肉組織、紅細胞及血小板中，是有機磷農(nóng)藥共同的作用靶點，活性部位絲氨酸殘基與有機磷結(jié)合后活性被抑制，其活性抑制是有機磷農(nóng)藥中毒的主要機制，也是評價有機磷農(nóng)藥中毒程度的一個重要生物標志［4－5］。

毒死蜱進入機體后要先經(jīng)氧化酶的代謝活化作用生成活性中間產(chǎn)物，即毒死蜱氧化物才能作用于靶組織中的ACh E發(fā)揮毒作用，造成膽堿受體功能紊亂，使有膽堿受體的器官功能發(fā)生障礙，氧化后的毒死蜱經(jīng)對氧磷酶（paraoxonase-1，PON-1）等水解酶的作用，降解生成解毒后的代謝產(chǎn)物，即磷酸二乙酯（diethylphosphate，DEP）和3，5，6－三氯-2-吡啶（3，5，6-trichlor opyridinol，TCP）［6－7］。

本實驗制備的131I-Chlorpyrif os標記物體外穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，標記后48 h的放化純度大于90%（溶于新鮮人血清中），適于Chlorpyrif os在體內(nèi)外的微量示蹤研究，為下一步研究提供了可靠保障。利用131I-Chlorpyrif os具有靈敏準確的放射性示蹤特點，可用于觀察分析其在整體生物體內(nèi)的代謝過程和可能的作用靶點。

分布實驗的結(jié)果顯示，靜脈注射后131IChlor pyrif os在體內(nèi)廣泛分布，主要分布于心、肝、脾、肺、小腸、大腸、肌肉和頜下腺中，其中，以肺分布最多，腎、小腸、大腸、肌肉和頜下腺次之，說明肺臟等諸多器官對Chlorpyrif os具有很高的攝取率，這可能是毒死蜱與肺癌的發(fā)生可能存在某些聯(lián)系的原因之一［8］，腎、肝臟是其主要的代謝臟器，此結(jié)果提示碘標131I-Chl orpyrifos可為探討Chlorpyrif os分布代謝的研究提供一個靈敏的分析方法。Chlor pyrif os在腦、脊髓中亦有一定分布，揭示其能夠透過血腦屏臟（BBB），與文獻報道一致［9－11］。

131I-Chlorpyrif os在甲狀腺內(nèi)的放射性隨時間的延長而逐漸增加，反映出其在體內(nèi)有一個漸進性的脫碘過程，也證明了毒死蜱進入體內(nèi)后存在氧化過程；同時體外穩(wěn)定性實驗結(jié)果也顯示其在生理鹽水中穩(wěn)定，從分子結(jié)構(gòu)分析，其分子結(jié)構(gòu)存在的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)使得整個分子呈脂溶性，這是分子易于透過BBB的重要原因之一，也是其在生理鹽水中穩(wěn)定的原因之一，所以本實驗采用DMSO溶解效果較生理鹽水好。

以往研究毒死蜱體內(nèi)代謝及分布實驗，大都采用液相色譜等方法，組織樣品處理時比較繁瑣［5－7］，而用碘標的131I-Chl or pyrif os研究代謝實驗時，組織樣品無需特殊處理，直接測量即可靈敏地反映其在小鼠體內(nèi)的基本代謝過程，若進一步結(jié)合其他分子生物學技術(shù)還可分析其在體內(nèi)精確的代謝行為及可能的作用機制。

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