郭曉榕 劉 曉 李 潔 吳 敏 湛先保

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(200433)

腸黏膜屏障功能損害是急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與疾病預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。正常情況下，腸黏膜與黏膜下層之間有一道具有高度選擇性的機(jī)械屏障，上皮細(xì)胞間連接復(fù)合體和主要緊密連接結(jié)構(gòu)由多種蛋白組成，其中 occludin和 ZO-1(zonula occludens-1)蛋白對(duì)維持正常屏障結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義［3］。替普瑞酮(teprenone)為臨床常用胃黏膜保護(hù)劑，其在治療胃炎、胃潰瘍、防治乙醇、非甾體消炎藥(NSAIDs)等因素相關(guān)性胃黏膜損傷中的作用已得到廣泛認(rèn)可［4-5］，對(duì)于各種原因引起的腸黏膜損傷，替普瑞酮同樣發(fā)揮重要保護(hù)作用［5-8］。本實(shí)驗(yàn)以腹部皮下注射雨蛙素(cerulein)建立水腫型AP大鼠模型，并予替普瑞酮灌胃干預(yù)，通過(guò)觀察血清促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平、腸黏膜形態(tài)學(xué)以及上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)的變化，探討替普瑞酮對(duì)AP腸黏膜屏障的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為替普瑞酮應(yīng)用于AP臨床治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)量180～220 g(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。替普瑞酮［衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司］于使用前配制成新鮮混懸液;雨蛙素(Sigma-Aldrich Co.);IL-1、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒(Takara Bio Company);淀粉酶ELISA試劑盒(QIAGEN);羊抗鼠occludin、ZO-1 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.);熒光標(biāo)記兔抗羊二抗(Cell Signaling Technology，Inc.，工作濃度 1∶100)。

二、方法

1.水腫型AP大鼠模型建立和分組:采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組:正常對(duì)照組(n=5)、AP模型組(n=20)和替普瑞酮治療組(n=20)。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，不限飲水，造模大鼠腹部皮下注射雨蛙素20μg/(kg·h)，共4次;正常對(duì)照組大鼠腹部皮下注射等體積0.9%NaCl溶液。替普瑞酮治療組于造模前2 h和造模后2 h予替普瑞酮1000 mg/kg灌胃。術(shù)后12 h麻醉、處死大鼠，心臟穿刺取血，離心取上清液，－20℃保存待測(cè)。打開(kāi)腹腔分離小腸，取距回盲部5 cm處回腸組織，0.9%NaCl溶液漂洗，用于后續(xù)檢查。

2.血清促炎細(xì)胞因子和淀粉酶檢測(cè):采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.組織病理學(xué)檢查:回腸組織標(biāo)本4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4～5μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取20個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察。

4.超微結(jié)構(gòu)觀察:回腸組織標(biāo)本2.5%戊二醛溶液4℃前固定2 h以上，PBS漂洗3次，1%鋨酸后固定約1 h，1%乙酸鈾塊染2 h，梯度丙酮脫水，逐步浸透包埋，修塊后半薄切片光學(xué)顯微鏡下定位，每張切片隨機(jī)選取50個(gè)高倍視野，日立H-7500型透射電子顯微鏡下觀察。

5.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) occludin、ZO-1蛋白表達(dá):回腸組織剪碎后加入 RIPA 300μL、PMSF 5μL研磨勻漿1 min，轉(zhuǎn)移至EP管，冰上放置30 min，期間振蕩3次，離心取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜，分別加入一抗和二抗孵育，LI-COR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)觀察、拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清促炎細(xì)胞因子和淀粉酶水平

與正常對(duì)照組相比，AP模型組血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平顯著升高，提示炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而替普瑞酮治療組各項(xiàng)指標(biāo)均較AP模型組顯著降低，提示替普瑞酮干預(yù)對(duì)AP時(shí)的全身性炎性反應(yīng)和胰腺組織破壞有一定抑制作用(表1)。

二、小腸黏膜組織病理學(xué)變化

正常對(duì)照組小腸黏膜絨毛完整，黏膜下層次結(jié)構(gòu)清楚;AP模型組小腸黏膜水腫變性，絨毛壞死脫落，局部上皮細(xì)胞與固有層分離;替普瑞酮治療組僅出現(xiàn)黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小腸絨毛仍較完整，未見(jiàn)壞死脫落，提示替普瑞酮干預(yù)對(duì)AP時(shí)的小腸黏膜完整性有一定保護(hù)作用(圖1)。

三、小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化

正常對(duì)照組小腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間緊密連接致密;AP模型組微絨毛脫落、斷裂，緊密連接明顯增寬，與組織病理學(xué)變化相一致;替普瑞酮治療組微絨毛和緊密連接破壞較AP模型組明顯改善，形態(tài)接近正常對(duì)照組，提示替普瑞酮干預(yù)對(duì)AP時(shí)的小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用(圖2)。

四、小腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，AP模型組小腸黏膜組織occludin、ZO-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而替普瑞酮治療組兩種蛋白表達(dá)均較AP模型組增強(qiáng)，提示替普瑞酮干預(yù)可增強(qiáng)AP時(shí)的小腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)(圖3)。

圖1 各組大鼠小腸黏膜組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

圖3 各組大鼠小腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障、免疫屏障等組成，不同屏障的結(jié)構(gòu)、分子調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能各不相同，協(xié)同防御外來(lái)物質(zhì)的侵襲［9-10］。腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)包繞在上皮細(xì)胞靠近腸腔的一側(cè)，受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，影響整個(gè)腸黏膜屏障的通透性。該結(jié)構(gòu)可有效阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素、炎性介質(zhì)等的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性［11-12］。重癥急性胰腺炎(SAP)時(shí)，腸道不僅是膿毒癥的靶器官，更是全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)以及局部和全身感染的啟動(dòng)部位，腸黏膜屏障功能受損致黏膜通透性增高，細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，釋放炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，啟動(dòng)SIRS并引起多器官功能障礙綜合征(MODS);同時(shí)，細(xì)菌和毒素進(jìn)入循環(huán)后引起胰腺及其周?chē)M織繼發(fā)感染，是SAP患者死亡的主要原因［13-14］。因此，研究腸黏膜屏障的損傷機(jī)制，并采取相應(yīng)防治措施，對(duì)于改善AP患者的預(yù)后具有重要意義。

表1 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平比較

替普瑞酮作為一種抗?jié)兯帲驯蛔C實(shí)在胃黏膜細(xì)胞保護(hù)中起重要作用。2005年Ohkawara等［7］發(fā)現(xiàn)替普瑞酮對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)效應(yīng)，表明替普瑞酮在腸道細(xì)胞保護(hù)中亦發(fā)揮重要作用。Iwai等［8］評(píng)估了替普瑞酮對(duì)小腸黏膜的保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其可增加大鼠小腸黏膜黏蛋白，尤其是唾液黏蛋白的分泌，減輕洛索洛芬鈉誘導(dǎo)的小腸黏膜損傷，并發(fā)現(xiàn)該保護(hù)機(jī)制可能與抑制腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)有關(guān)，提示了替普瑞酮治療腸道黏膜損傷、保護(hù)腸黏膜屏障功能的潛力。Niwa等［5］開(kāi)展的前瞻性隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照交叉試驗(yàn)證實(shí)替普瑞酮對(duì)NSAIDs相關(guān)性胃腸黏膜損傷具有保護(hù)作用，以膠囊內(nèi)鏡對(duì)胃腸黏膜損傷進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)替普瑞酮加雷貝拉唑與安慰劑加雷貝拉唑相比，能明顯減輕雙氯芬酸鈉引起的胃和小腸黏膜損傷?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)論，推測(cè)替普瑞酮對(duì)AP時(shí)的腸黏膜屏障損傷亦可能具有潛在保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，造模前后給予替普瑞酮灌胃干預(yù)的AP模型大鼠，血清促炎細(xì)胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α 水平顯著降低，提示替普瑞酮干預(yù)對(duì)AP時(shí)的全身性炎癥反應(yīng)有一定抑制作用，同時(shí)該組小腸黏膜組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)病變明顯減輕，血清淀粉酶水平顯著下降，提示替普瑞酮能保護(hù)AP時(shí)的小腸黏膜完整性和超微結(jié)構(gòu)，改善胰腺組織破壞和小腸黏膜損傷。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，替普瑞酮干預(yù)可增強(qiáng)AP大鼠模型小腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)主要功能蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)，提示替普瑞酮可能通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)參與了AP時(shí)腸黏膜屏障的保護(hù)。該作用是否能進(jìn)一步減輕胰腺組織學(xué)損傷，提高AP模型大鼠的生存率，尚有待進(jìn)一步研究。

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