劉 雷 陳國昌 宋振云 郜恒駿 陳衛(wèi)昌

江蘇省宜興市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(214200) 生物芯片上海國家工程研究中心2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科3

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號(hào)通路為一重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、炎癥反應(yīng)等多種生理和病理生理過程。Runx3和Smad4是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，兩者為TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。p21和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)同樣在TGF-β信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，p21可通過抑制CDKs復(fù)合物活性協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等因素，進(jìn)而對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響［2-3］。近年來，組織芯片技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于惡性腫瘤相關(guān)研究，本研究應(yīng)用組織芯片技術(shù)聯(lián)合免疫組化方法檢測(cè)并分析Runx3、Smad4、Cdk2、p21在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，探討四者在胃癌中的生物學(xué)意義及其用于胃癌預(yù)后判斷的臨床價(jià)值。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年10月-2007年5月胃癌根治手術(shù)標(biāo)本130例，其中男101例，女29例，年齡27 ～80歲，平均(62.7 ±15.2)歲。入選病例術(shù)前均未行化、放療，診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，病史資料完整，出院后通過電話、信件隨訪，截止日期為2011年10月1日。共獲得癌組織石蠟塊130例，癌旁組織248例(距腫瘤邊緣2 cm以內(nèi)和5 cm以外各124例)，胃癌組織學(xué)分型和臨床病理分期分別參照2000年WHO推薦的分型標(biāo)準(zhǔn)和2002年第6版UICC/AJCC TNM分期。

二、組織芯片制作

供體組織蠟塊常規(guī)切片、HE染色，由病理專家作二次診斷，并在切片上標(biāo)記典型病變部位。使用組織芯片制作儀(Beecher Instruments Inc.)在受體蠟塊(空白蠟塊)上打孔(直徑1.0 mm和1.5 mm)，根據(jù)HE染色切片上標(biāo)記的病變部位，在供體組織蠟塊的相應(yīng)位置獲取相同直徑的組織芯，置入受體蠟塊陣列孔中，記錄組織編號(hào)。每塊組織取2個(gè)組織芯，共制成4塊陣列塊，4μm厚連續(xù)切片，組織芯片切片中的每個(gè)點(diǎn)均經(jīng)病理診斷證實(shí)。

三、免疫組化染色和結(jié)果判斷

兔抗人Runx3、Cdk2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Smad4單克隆抗體購自R＆D Systems，Inc.，鼠抗人p21單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。采用EnVision二步法，嚴(yán)格按試劑盒(DAKO公司)說明書進(jìn)行操作。于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)不少于1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色細(xì)胞百分率。異常表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)均參照相關(guān)文獻(xiàn):①Runx3，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒，染色細(xì)胞≥10%為正常表達(dá)，＜10%為異常表達(dá);②Smad4，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或褐色顆粒，染色細(xì)胞≥50%為正常表達(dá)，＜50%為異常表達(dá);③Cdk2，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，染色細(xì)胞≤10%為正常表達(dá)，＞10%為異常表達(dá);④p21，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒，染色細(xì)胞＞5%為正常表達(dá)，≤5%為異常表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法;相關(guān)性的分析采用 Spearman秩相關(guān)系數(shù);以Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計(jì)算生存率，兩組間比較采用log-rank檢驗(yàn);以Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型行預(yù)后因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 在不同胃組織中的表達(dá)

130 例胃癌組織中，Runx3、Smad4、Cdk2、p21 異常表達(dá)率分別為 67.7%、35.4%、63.8% 和 70.0%，248 例癌旁組織中則分別為 14.1%、12.5%、18.1%和37.1%，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。將癌旁非癌組織根據(jù)病理診斷分組作進(jìn)一步分析，從正常胃組織、慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生至胃癌，四種蛋白異常表達(dá)率大致呈上升趨勢(shì)，其中正常胃組織、慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生組織均顯著低于胃癌組織(P＜0.05)，而異型增生組織僅Runx3異常表達(dá)率顯著低于胃癌組織(P＜0.05)，Smad4、Cdk2、p21異常表達(dá)率與胃癌組織無明顯差異(P ＞0.05)(圖1、表1)。

二、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

分析顯示，Runx3異常表達(dá)與胃癌組織學(xué)分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤深度和TNM分期無關(guān)((P＞0.05);Smad4和p21異常表達(dá)僅與胃癌組織學(xué)分型有關(guān)(P ＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期無關(guān)(P＞0.05);Cdk2異常表達(dá)與胃癌組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、部位和浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)(表2)。

三、胃癌組織中 Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達(dá)的相關(guān)性

130例胃癌組織中，Runx3與Smad4均異常表達(dá)者45例，均正常表達(dá)者41例，兩者呈正相關(guān)(rs=0.387，P＜0.05);Runx3與p21均異常表達(dá)者85例，均正常表達(dá)者36例，兩者呈正相關(guān)(rs=0.840，P＜0.05);Runx3與Cdk2均異常表達(dá)者78例，均正常表達(dá)者37例，兩者呈負(fù)相關(guān)(rs= －0.312，P ＜0.05);Smad4與p21均異常表達(dá)者43例，均正常表達(dá)者36例，兩者呈正相關(guān)(rs=0.298，P ＜0.05);Smad4 與Cdk2均異常表達(dá)者26例，均正常表達(dá)者27例，兩者間無相關(guān)性(rs= －0.089，P＞0.05);Cdk2與 p21均異常表達(dá)者52例，均正常表達(dá)者8例，兩者間無相關(guān)性(rs= －0.211，P ＞0.05)。

四、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系

130例患者隨訪53～84個(gè)月，中位隨訪期65個(gè)月，死亡74例，失訪12例，隨訪率為90.8%，總體中位生存時(shí)間為32個(gè)月，5年生存率為37.3%。Runx3、Smad4、p21異常表達(dá)組5年生存率分別顯著低于相應(yīng)正常表達(dá)組(P＜0.05)，Cdk2異常表達(dá)與正常表達(dá)組間5年生存率無明顯差異(P＞0.05)(表3)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析顯示，在各項(xiàng)潛在預(yù)后因素(性別、年齡、腫瘤大小、部位、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期以及Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達(dá))中，Runx3 和 Smad4為胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)(免疫組化EnVision二步法，×200)

表1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在不同胃組織中的異常表達(dá)情況n(%)

表2 Runx3、Smad4、Cdk2、p21表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

表3 Runx3、Smad4、Cdk2、p21異常表達(dá)與正常表達(dá)組生存情況比較

討 論

TGF-β信號(hào)通路在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，該通路相關(guān)分子主要包括TGF-β受體(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)、Runx3、Smad4、Cdk2、p21、p27、cmyc等［2］。在 TGF-β-Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Runx蛋白(包括Runx3)介導(dǎo)Smads復(fù)合物從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，兩者共同參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等的調(diào)控［4］。研究發(fā)現(xiàn)Runx3失活可引起小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖增強(qiáng)和凋亡抑制，導(dǎo)致胃黏膜異常增生甚至癌變，Runx3的抑癌機(jī)制至少部分與協(xié)同TGF-β-Smad 信號(hào)誘導(dǎo) p21 表達(dá)有關(guān)［5］;胃癌組織中Smad表達(dá)明顯下調(diào)，并與預(yù)后不良有關(guān)［6］。Runx3與Smad4協(xié)同誘導(dǎo)p21表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，p21表達(dá)激活又可抑制Cdk2、Cdk4，進(jìn)一步發(fā)揮抑癌作用。由此可見，TGF-β信號(hào)通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21之間存在相互影響。本研究分析了這四種蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況、四者與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系以及四者間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Runx3、Smad4、p21表達(dá)下調(diào)或缺失，Cdk2表達(dá)上調(diào)，四者分別與胃癌組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期中的一項(xiàng)或多項(xiàng)有關(guān);除Cdk2僅與 Runx3相關(guān)外，Runx3、Smad4、p21三者的異常表達(dá)兩兩相關(guān)，且均與預(yù)后不良有關(guān)，其中Runx3和Smad4是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

本組130例胃癌組織中67.7%存在Runx3異常表達(dá)，而248例癌旁組織中Runx3異常表達(dá)率僅為14.1%，從正常胃組織、慢性胃炎、癌前病變(腸上皮化生和異型增生)至胃癌的演進(jìn)過程中，Runx3異常表達(dá)率逐步上升，提示Runx3或可作為早期胃癌的預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)結(jié)直腸腫瘤的研究同樣顯示Runx3失活是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件［7］，與本研究結(jié)果一致。肝細(xì)胞癌組織中亦存在Runx3表達(dá)下調(diào)或缺失［8］。本研究中Smad4異常表達(dá)率從正常胃組織至癌前病變上升趨勢(shì)并不明顯，從癌前病變至胃癌則有較明顯的增加，提示Smad4失活屬于癌變晚期分子事件，與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。

Cdk2是CDKs蛋白家族的重要成員，作為細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，增加腫瘤細(xì)胞的惡性表型和侵襲性［10］。p21為CDKs抑制劑之一，既往觀點(diǎn)認(rèn)為其可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長，然而近年研究卻發(fā)現(xiàn)p21在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌以及多種鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，表明p21在不同惡性腫瘤中可呈現(xiàn)抑癌或促癌活性［3］。本研究發(fā)現(xiàn)p21在胃癌中表現(xiàn)為抑癌活性，p21表達(dá)正常的胃癌患者5年生存率顯著長于表達(dá)低下者。p21在不同惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用可能與以下因素有關(guān)［3］:①p21基因多態(tài)性導(dǎo)致其功能的多樣性，且 p21受 p53、Cdk2、Smads等多種分子影響;②p21可通過激活E2F、抑制Cdk2而抑制細(xì)胞周期，但同時(shí)又可抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，參與DNA修復(fù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21 可相互影響并可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，其中Runx3、Smad4、p21表達(dá)與胃癌患者的生存期有關(guān)，異常表達(dá)組5年生存率顯著低于正常表達(dá)組，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型提示Runx3和Smad4為胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。然而，胃癌發(fā)生的影響因素眾多，本研究標(biāo)本選取時(shí)未剔除術(shù)前曾服用中藥者以及幽門螺桿菌(Hp)感染病例(Hp感染可能對(duì)TGF-β信號(hào)通路產(chǎn)生激活作用)，且Runx3、Smad4、p21之間存在兩兩相關(guān)關(guān)系，因此Runx3和Smad4能否作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一，尚有待進(jìn)一步研究。

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