劉志國(guó)，崔步云，王 妙，劉日宏，夏咸柱

布氏菌分離株16SrDNA基因遺傳進(jìn)化分析

劉志國(guó)1,2，崔步云3，王 妙2，劉日宏2，夏咸柱1,4

目的 檢測(cè)內(nèi)蒙古布氏菌臨床分離株的16SrDNA基因序列，構(gòu)建16SrDNA遺傳進(jìn)化樹(shù)，確定該菌株的分類(lèi)地位。方法 用BCSP31-PCR對(duì)臨床分離株檢測(cè)，再進(jìn)行16SrDNA雙向測(cè)序；從GeneBank下載標(biāo)準(zhǔn)參考菌株和與布氏菌有共同抗原細(xì)菌的16SrDNA基因序列；用Mega6.0進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 BCSP31-PCR結(jié)果顯示均有223 bp擴(kuò)增條帶，16SrDNA測(cè)序得到單一基因序列；比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有4處特異片段，經(jīng)Blast比對(duì)，位于844-1224包括380 bp的片段為布氏菌獨(dú)有；進(jìn)化樹(shù)顯示布氏菌臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株聚在1個(gè)末端分支上，遺傳距離接近0，無(wú)法精細(xì)區(qū)分相互關(guān)系；與人蒼白桿菌聚集在1個(gè)亞分支上，遺傳距離0.019；與其它試驗(yàn)菌株如霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾菌遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，遺傳距離>0.02。結(jié)論 從遺傳進(jìn)化角度對(duì)布氏菌分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，布氏菌所有種型遺傳距離接近，提示布氏菌16SrDNA為高度保守序列，不宜做遺傳進(jìn)化分析的靶基因；布氏菌與人蒼白桿菌有較近的親緣關(guān)系；布氏菌屬16SrDNA特有的380 bp的基因片段可作為布氏菌快速鑒定的靶序列。

布氏菌；16S rDNA；遺傳進(jìn)化；分析

布氏菌病(brucellosis)是由布氏菌引起的人獸共患傳染病，世界范圍廣泛流行，在我國(guó)流行的主要是羊、牛種布氏菌；羊種菌造成人間布病的暴發(fā)，而牛種、豬種菌則多引起散發(fā)[1-3]。

近年，細(xì)菌的分類(lèi)學(xué)方法發(fā)展飛速，已從單一的表型分類(lèi)發(fā)展為系統(tǒng)性分類(lèi)即利用表型、遺傳型和系統(tǒng)發(fā)育信息等多種途徑來(lái)區(qū)分細(xì)菌，進(jìn)而闡述細(xì)菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系。特以16S rDNA基因序列測(cè)定鑒定布氏菌并闡述其進(jìn)化關(guān)系[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器試劑 生物安全柜(美國(guó)Thermo)，梯度PCR擴(kuò)增儀、PCR管離心機(jī)、高速離心機(jī)均為德國(guó)Sigma公司；電泳儀(北京八一儀器廠(chǎng))；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。DL2000 Marker(全氏金生物公司)；DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)；BCSP31-PCR引物由天一輝遠(yuǎn)生物公司完成。

1.1.2 菌株來(lái)源 牛種標(biāo)準(zhǔn)菌株544A羊種標(biāo)準(zhǔn)菌株16M，大腸桿菌O∶157DNA均來(lái)自中國(guó)疾控中心傳染病所布病室。布氏菌臨床分離株系2012-2014年分離自來(lái)烏蘭察布市地方病防治中心就診的布病患者血液樣本，共20株，患者均來(lái)源于烏蘭察布市的8個(gè)旗縣，患者均有養(yǎng)羊史或羊接觸史，菌株編號(hào)為：C1～C17，C19、C21和C22。

1.1.3 細(xì)菌DNA的提取 按照天根細(xì)菌基因組提取試劑盒推薦步驟進(jìn)行。

1.1.4 擴(kuò)增引物 布氏菌屬聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(BCSP31-PCR)擴(kuò)增引物參照參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 測(cè)序 將BCSP31-PCR擴(kuò)增后，20株代表性陽(yáng)性菌株DNA送天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行16SrDNA全序列測(cè)定。

1.2.4 序列比對(duì) 用Mega6.06軟件中的ClustalW功能，對(duì)試驗(yàn)菌株的序列比對(duì)，并查找特異序列。

1.2.5 遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將上述比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Mega6.06軟件中，采用Neighbor-Joining法，構(gòu)建試驗(yàn)菌株16S rDNA進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 布氏菌BCSP31-PCR擴(kuò)增結(jié)果 BCSP31-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳顯示所有臨床分離菌株均在約223 bp處有擴(kuò)增條帶，與參考菌株一致。

2.2 16S rDNA測(cè)序結(jié)果 測(cè)序取得了單一的核苷酸序列，然后根據(jù)測(cè)序峰值圖刪除兩端可信度較差的序列，所有測(cè)序菌株均得到了約為1 350 bp大小的基因序列，上述序列經(jīng)Blast比對(duì)顯示：Expect為0.0；Identities為100%，證實(shí)該菌株序列與布氏菌的16S rDNA基因序列100%吻合。

2.3 布氏菌臨床分離株、標(biāo)準(zhǔn)菌株和與布氏菌有共同抗原細(xì)菌的16S rDNA比對(duì)結(jié)果 用ClustalW軟件做上述序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)臨床分離株和布氏菌標(biāo)準(zhǔn)株在16S rDNA基因上差異甚微；以B.abortus544A(GeneBankNR：042460)為基準(zhǔn)，在位置101-142(序列：5′-GGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCATTT-3′)、228-260(序列：TGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAG

TTGGTGG)和844-1224(序列：5′-CGGGGTGTTTACACTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAA

ACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA

TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG

CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG

AAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTG

ACATCCCGGTCGCGGTTAGTGGAGACACT

ATCCTTCAGTTAGGCTGGACCGGAGACAG

GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCA

TTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGAC

GTCAAGTCCTCATGGCCC-3′)有3處特異性序列；對(duì)這3段特異性序列在NCBI做BLAST，發(fā)現(xiàn)位于844～1224處包含380 bp的核苷酸序列為布氏菌屬基因特異性片段，見(jiàn)圖1。

2.4 遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果 以16S rDNA基因構(gòu)建的上述試驗(yàn)的遺傳進(jìn)化樹(shù)表明，布氏菌臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株緊密聚集在進(jìn)化樹(shù)的同一末端分支上，遺傳距離幾乎相同，無(wú)法精細(xì)區(qū)分相互關(guān)系；與人蒼白桿菌聚集形成了分支，未與布氏菌屬聚為一類(lèi)，遺傳距離約為0.019，提示有較近的親緣關(guān)系；其他實(shí)驗(yàn)菌株如霍亂弧菌、巴爾通體，包括與布氏菌交叉凝集的耶爾森菌O∶9型，均聚集在了不同的分支中，提示遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。見(jiàn)圖2。

圖1 布氏菌16S rDNA 844～1224處的部分特異序列

圖2 布氏菌臨床分離株16S rDNA遺傳進(jìn)化樹(shù)

Fig.2 Phylogenetic tree of clinical isolates ofBrucellastrains 16S rDNA

3 討 論

目前，布氏菌病診斷檢測(cè)和基因特征分析的方法多樣，血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)單、快速適用，但由于許多菌株與布氏菌有共同抗原，容易發(fā)生交叉反應(yīng)[7]，導(dǎo)致誤診、漏診；傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法操作繁瑣、周期長(zhǎng)、且有約10%～30%的菌株成為無(wú)法鑒定的非典型菌株[8]。所以，布氏菌的分離培養(yǎng)仍是布病感染的金標(biāo)準(zhǔn)，亦是進(jìn)行基因研究和闡明遺傳進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)。布氏菌16S rDNA基因序列分析，可以對(duì)布氏菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分類(lèi)鑒定，還可用于確定菌株的分類(lèi)地位、種系發(fā)生[9]。

細(xì)菌的16S rDNA 普遍存在于原核生物中，而且在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)歷程中保持不變，可看作為生物演變的時(shí)間鐘，其分子中既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域即含有具有交替的保守區(qū)域和異質(zhì)性區(qū)域的特點(diǎn)[10]，它適用于進(jìn)化距離不同的各類(lèi)生物親緣關(guān)系的研究。本文對(duì)20株布氏菌進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析，BCSP31-PCR的鑒定均為布菌屬。BCSP31-PCR方法在屬的水平上鑒定布氏菌菌株，是OIE推薦鑒定方法之一。16S rDNA基因序列測(cè)定，BLAST結(jié)果顯與布氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株序列相似性為100%；顯示16S rDNA基因序列在布氏菌屬中高度保守，與先前研究結(jié)果一致[11]。以牛種布氏菌的16S rRNA 全序列 (GenBank：NR_114469)為基準(zhǔn)，在位置101-142 有3處為布氏菌屬基因特異性片段，可作為快速分型鑒定的靶序列，可用于建立布氏菌的快速鑒定。進(jìn)化樹(shù)是用樹(shù)狀結(jié)構(gòu)來(lái)表示物種或者序列之間的演化關(guān)系，揭示物種隱含的種系關(guān)系,在進(jìn)行分子進(jìn)化中研究重要意義。本試驗(yàn)基于試驗(yàn)菌株的16S rDNA基因，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建了布氏菌及相關(guān)菌株的分子進(jìn)化樹(shù)。本試驗(yàn)構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示遺傳距離為0.02，即試驗(yàn)菌株核苷酸序列同源性差異為2%即同源性為98%，代表試驗(yàn)菌株基因中每100個(gè)核苷酸/氨基酸中有2個(gè)不同；進(jìn)化樹(shù)的Bootstrap檢驗(yàn)值均在97以上，表明該進(jìn)化樹(shù)可信度較高，一般該值大于70較為可信[12]。進(jìn)化分析結(jié)果顯示不同地域、年代、種型的臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株聚集在進(jìn)化樹(shù)的末端分支上，表明分離株均為布氏菌，但遺傳距離很接近，無(wú)法精細(xì)的區(qū)分種型和相互關(guān)系，這與 Boye K等[13]的研究結(jié)果一致。進(jìn)化樹(shù)提示布氏菌16SrDNA為高度保守序列，適合種屬鑒定，不宜做遺傳進(jìn)化分析的靶基因，應(yīng)選擇保守性相對(duì)較差的基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；而布氏菌與人蒼白桿菌聚集在了一個(gè)亞分支上，且16S rDNA基因同源性較高，遺傳距離約為0.019，提示有較近親緣關(guān)系，這與Velasc J等[14]的試驗(yàn)結(jié)果相吻合；布氏菌屬與其它試驗(yàn)菌株如霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾菌等聚集在不同的進(jìn)化分支上，遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，提示親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。分離株C17在用常規(guī)試驗(yàn)方法鑒定時(shí)，鑒定為可疑布氏菌株，而16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果顯示該菌株為布氏菌屬細(xì)菌，表明布氏菌16S rDNA序列測(cè)定在非典型株或可疑菌株的分類(lèi)鑒定中具有較好的作用。

16SrDNA已廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌遺傳特征和分子差異的研究，尤其適用于臨床中不能或不易培養(yǎng)的病原和未知病原的分類(lèi)鑒定，大量已知細(xì)菌的16SrDNA數(shù)據(jù)都被測(cè)定并輸入到國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù),使之成為對(duì)細(xì)菌鑒定和分類(lèi)非常有用的參照系統(tǒng)；而且16SrDNA序列的相似性已成為劃分屬的標(biāo)準(zhǔn),屬內(nèi)相似性不低于95%[15]。布氏菌16S rDNA序列測(cè)定不僅試驗(yàn)結(jié)果直觀(guān)、分類(lèi)鑒定準(zhǔn)確、信息易于電子存檔，便于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)；而且能夠進(jìn)行布氏菌遺傳進(jìn)化、分子差異等方面的試驗(yàn)研究。

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s: Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

Gene genetic evolution of 16SrDNA forBrucellastrains

LIU ZHi-guo1,2,CUI Bu-yun3,WANG Miao2,LIU Ri-hong2,XIA Xian-zhu1,4

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2.UlanqabCentreforEndimicDiseaseControl,Ulanqab012000,China;3.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China;4.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

We detected 16SrDNA gene sequence ofBrucellastrains of Inner Mongolia clinical isolates and constructed 16SrDNA phylogenetic tree, in order to determine the taxonomic status. Clinical isolates were identified by BCSP31-PCR, and then the 16SrDNA was bidirectionaly sequenced; 16SrDNA gene sequences ofBrucellareference strains and present common antigen bacteria withBrucellawere downloaded from the GenBank; sequence was aligned by Mega6.0 and phylogenetic tree of experimental strains was constructed. Results showed that 223 bp specific fragments were amplified from allBrucellaclinical isolates by BCSP31-PCR; single sequence was obtained by 16SrDNA sequencing. By the sequence alignment with other test strains, 4 location specific fragments were found, 380 bp gene fragment located at 844-1 224 position of 16SrDNA, which was unique ofBrucellaspp. Phylogenetic tree revealed thatBrucellaisolates and standard strains clustered in one terminal branch, and the genetic distance was approximately close to 0. It’s was unable to precise distinct between the relationship, as the evolutionary distance was much closed. TheBrucellaisolates gathered in a one sub-branch withOchrobactrumanthropi, the genetic distance was about 0.019.Brucellaspp. was closely related to theOchrobactrumanthropi. The relative distances with other strains (such asVibriocholerae,Yersiniaenterocolitis bacteria) were greater than 0.02. In conclusion, phylogenetic relationship ofBrucellastrains isolated and standard strains were analyzed from genetic evolution perspectively, the genetic distances of all specific type were close, which hinted that 16SrDNA ofBrucellawas highly conserved sequence and was not suitable as a target gene forBrucellagenetic evolution analysis.BrucellaandOchrobactrumanthropihad closer genetic relationship; 16SrDNA specific 380 bp gene fragment ofBrucellagenus could be used as target sequences for rapid identification ofBrucella.

Brucella; 16S rDNA; genetic evolution; analysis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.003

夏咸柱, Email: xiaxzh@cae.cn; 崔步云, Email: cuibuyun@icdc.cn

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.烏蘭察布市地方病防治中心，烏蘭察布 012000； 3.中國(guó)疾病預(yù)防中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206； 4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,長(zhǎng)春 130122

Funded by the Health Scientific Research Project of Health and Family Planing Commission of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 201301094)

R378

A

1002-2694(2015)08-0700-04

2014-09-17；

2014-12-26