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（吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，長春130033）

肝臟缺血再灌注損傷機制的研究進展

關連越，付佩堯（綜述），李 ?。ǎ獙徯＃?/p>

（吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，長春130033）

組織經歷一定時間的缺血后恢復血流灌注，不僅無法使組織器官功能得以迅速恢復正常，反而加重組織器官炎癥反應、結構破壞、甚至出現嚴重功能障礙，這一過程被稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。這種損傷常發(fā)生于醫(yī)療過程中，如器官移植、溶栓治療、動脈搭橋術、體外循環(huán)心臟手術、低血容量性休克等，進而出現肝、腦、心、肺、腎、腸等多器官功能損傷，成為影響缺血治療效果的一個重要因素。其中肝臟IRI（HIRI）最為常見和嚴重，限制了肝切除術的適應癥及邊緣性肝臟供體的應用，在不同程度上阻礙了肝臟外科及肝移植的發(fā)展和普及。HIRI可分為熱缺血再灌注損傷及冷缺血再灌注損傷，二者發(fā)生的病理生理過程相似，其機制涉及諸多因素，與代謝障礙、氧化應激、細胞活化、炎癥反應等有關，各個因素形成相互制約、相互促進的關系。近些年，蛋白酶抑制劑、自由基清除劑、鈣通道阻滯劑、某些激素或中藥等均已被證實可從多種途徑有效抑制HIRI。目前，新型免疫抑制的應用及基因治療等也逐漸成為人們研究的焦點。本文綜合國內外研究資料就HIRI發(fā)生發(fā)展的常見機制（見圖1）加以綜述。

圖1 肝臟缺血再灌注損傷機制

1 無氧代謝與酸中毒

肝臟缺血時，組織處于缺血、缺氧狀態(tài)，細胞正常的氧化還原過程受阻，細胞內ATP被迅速消耗，依賴于ATP的各種細胞代謝活動也逐漸停止，無氧酵解增強引起乳酸、酮體等酸性代謝產物的蓄積，加上線粒體氧化磷酸化功能下降，致使組織細胞間pH值下降，出現代謝性酸中毒。復流后，pH值隨之恢復正常，大量pH值依賴性的蛋白酶、磷脂酶等活性增強，反而加重組織器官的損傷，造成HIRI［1］，此為HIRI最常見的機制之一。

2 線粒體損傷及膜滲透性的轉變

線粒體是機體氧化磷酸化的主要場所，其參與了HIRI的多個病理生理環(huán)節(jié)。缺血、缺氧狀態(tài)下活性氧及活性氮大量生成，破壞了細胞氧化磷酸化的過程，使ATP生成障礙，加上胞質內Ca2＋、Na＋、H＋等離子紊亂引起線粒體內離子失衡，最后導致線粒體膜結構及滲透性的改變（mitochondrial membrane permeability transition，MMPT）［2］。這種轉變主要表現在線粒體的腫脹及膜電位的下降，使分子量小于1 500kDa的溶質可以自由通過線粒體內膜［3］。引發(fā)MMPT有多種因素，包括線粒體內calpain－like蛋白酶的存在、Ca2＋濃度的升高、氧化劑等。少量MMPT時，溶酶體溶解，氧自由基（ROS）產生加快，ATP消耗，進而細胞色素C釋放至胞漿內，引起細胞凋亡；大量線粒體損傷時，ATP耗竭，細胞壞死，從而造成HIRI。

3 微循環(huán)衰竭

缺氧導致的內皮細胞損傷破壞了微脈管系統(tǒng)的完整性，進而導致血流量的減少，被稱為“無復流現象”［4］，可能的原因是縮血管物質和擴血管物質的大量產生，以及疾病本身導致的血管反應性的改變，造成這些物質局部比例失衡并最終導致缺血性損傷［5］。大量的實驗研究也證明了這樣的觀點，首先，移除擴血管物質一氧化氮（NO）可加重再灌注損傷，而加入外源性NO可減輕損傷［6］，此外，加入左旋精氨酸刺激NO的生成可降低門靜脈壓力，減輕再灌注損傷［7］。另一方面，缺血再灌注期間竇狀內皮細胞（SEC）和巨噬細胞可產生大量縮血管物質，如內皮素－1（ET－1），ET－1與肝臟星狀細胞表面受體結合通過收縮竇狀隙造成微循環(huán)障礙［8］。應用抗ET－1血清、抗內皮素單克隆抗體或ET受體拮抗劑可以有效改善再灌注后肝臟微血流，減輕組織損傷，提高細胞存活率［9，10］。

4 細胞內鈣離子（Ca2＋）超載

在正常生理狀態(tài)下，細胞膜的選擇通過性維持細胞內相對低鈣狀態(tài)，即鈣穩(wěn)態(tài)。缺血缺氧、氧化應激、細胞膜毒性物質等有害因素可引起鈣平衡系統(tǒng)功能失調，導致細胞內鈣超載。目前研究認為，鈣超載是造成肝細胞損傷的關鍵機制之一［11］。肝細胞或內皮細胞缺氧或復氧化后可出現細胞Ca2＋增加，使Ca2＋依賴性酶類，如鈣激活酶、蛋白激酶－C（PKC）、磷脂酶－C、鈣調蛋白依賴性的蛋白激酶－Ⅱ（CAMkinaseⅡ）和鈣調磷酸酶（蛋白磷酸酶2B）等活化，在內源性底物磷酸化、去磷酸化過程中起到重要作用，最終導致細胞的死亡或凋亡。因此，胞內Ca2＋超載后可引起線粒體內氧化磷酸化過程障礙，線粒體膜電位降低，組織ATP含量下降，以及胞漿內磷脂酶、蛋白酶等激活，導致細胞的不可逆性損傷。

5 氧化應激

大量研究表明，氧化應激過程在IRI中起到重要作用［11，12］。肝組織經歷缺血再灌注后，產生大量高活性分子如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS），前者包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，后者包括一氧化氮、二氧化氮和過氧化亞硝酸鹽等，二者作用機制相似。ROS主要來源包括細胞溶質內黃嘌呤氧化酶、KC、黏附的多形核中性粒細胞，作用于蛋白、酶類、核酸、細胞骨架、包膜和脂類過氧化物，導致線粒體功能低下和脂類過氧化反應；ROS可損傷內皮細胞使微脈管系統(tǒng)的完整性遭到破壞。內源性抗氧化物，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、維生素E等都可以抑制ROS的破壞作用。應用與腺病毒重組的超氧化物可有效減輕小鼠HIRI［13］。

6 KC和中性粒細胞的激活

肝臟缺血再灌注后誘發(fā)了體內炎性介質的復雜的級聯(lián)反應，首先KC被激活，活化的KC釋放出大量促炎因子，包括腫瘤壞死因子（TNF－α），白細胞介素（IL－1β）［14］，作用于肝細胞周圍誘導細胞因子和趨化因子的產生。進一步使中性粒細胞聚集、旋轉、吸引并隨后從血管腔內遷移至肝臟小間隙內?；罨闹行粤＜毎案闻K實質細胞可通過釋放氧化劑和蛋白酶造成肝損傷。中性粒細胞生成氧化劑的主要途徑來源于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，活化的NADPH氧化酶氧化NADPH，釋放出的電子降低氧分子電位，進一步產生超氧化物陰離子O2－，過氧化氫H2O2，羥自由基HO·，還原成H2O，從中性粒細胞中釋放出的髓過氧化物酶（以鹵化物形式存在的如Cl－）可以使過氧化氫H2O2轉變成次氯酸HOCl（另一種強效氧化劑），上述氧化劑的產生可直接造成肝細胞的損傷和（或）通過滅活內源性抗蛋白酶系統(tǒng)活性促進蛋白酶介導的肝細胞損傷。

7 細胞間黏附分子和內毒素的作用

細胞間黏附分子（ICAM－1），即CD54，在正常肝組織的SEC、血管內皮細胞和單核巨噬細胞中微弱表達，在實質性細胞內無表達。ICAM－1可通過與淋巴細胞功能相關抗原（LFA－1）的結合介導T淋巴細胞間，T、B淋巴細胞間，效應細胞與靶細胞間的相互作用，促進免疫系統(tǒng)的激活及免疫應答的發(fā)生。再灌注期間，活化的KC釋放炎性介質如TNF－α、IL－1等，可激活SEC和肝細胞，使ICAM－1的表達增加。ICAM－1可通過與其受體LFA－1的結合，促進中性粒細胞和內皮細胞的粘附、遷移、趨化，活化后釋放蛋白酶、氧化劑等造成肝細胞的損傷。有研究表明內毒素也參與了肝臟缺血再灌注損傷的過程［15］，肝臟缺血時一方面肝細胞功能下降，清除內毒素能力減弱，另一方面，腸黏膜屏障受損，菌群移位，釋放內毒素入血可經門靜脈回流入肝，進而激活KC，釋放促炎介質，活化中性粒細胞，通過NADPH氧化酶生成大量氧自由基加重肝損傷。

8 細胞死亡

近些年，許多實驗性數據均證實細胞凋亡存在于肝臟缺血再灌注過程中?；赥UNEL分析法、DNA梯度法和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）活性的檢測，判定再灌注期間有50%－70%的內皮細胞和40%－60%肝細胞發(fā)生凋亡［16］。然而仔細查閱這些數據，會發(fā)現一系列的疑問［17］，①單純應用TUNEL分析法判定細胞凋亡并不合適，因為DNA鏈的瓦解同樣存在于細胞腫脹性壞死過程中；②最小含量的caspase的活化與所謂的大規(guī)模的細胞凋亡沒有明顯的關聯(lián)；③即刻細胞內容物的釋放和炎癥反應與認為凋亡是細胞唯一死亡形式的看法不一致；④過度表達Bcl－2可同時抑制細胞的凋亡和壞死；⑤GUJRAL等人的研究結果基于形態(tài)學的判定標準，在熱缺血60分鐘后，發(fā)現內皮細胞和肝細胞發(fā)生凋亡的比例從未超過1%－2%，因此推斷細胞腫脹性壞死是肝臟缺血再灌注期間細胞的主要損傷形式，而并非凋亡［18］。類似的結果也出現在冷保存再灌注的實驗研究中［19］。

9 細胞因子的作用

細胞因子在HIRI過程中起著抗炎、促炎反應的雙重作用，TNF－α是促進炎癥級聯(lián)反應的主要因素，它由KC活化后分泌，可通過旁分泌和內分泌途徑作用于周圍組織和遠隔器官，是HIRI后繼發(fā)遠隔器官損傷的關鍵因素［20］。TNF－α的上調將直接導致肝臟的損傷，TNF－α與肝細胞表面受體結合后，使上皮中性粒細胞活化肽78（ENA－78）和ROS生成增多，同時激活核因子kB（NF－kB）和絲裂源活化蛋白激酶（MAPK）c－Jun氨基端激酶（JNK）［21］。此外，TNF－α還能上調ICAM－1、血管細胞黏附分子－1（VCAM－1）和P－選擇素的表達［20，22］。上述這些介質可通過各種途徑，使白細胞聚集、活化并進入缺血后的肝臟，而且，JNK和ROS可以直接作用于細胞造成肝臟損傷。其它一些重要的細胞因子還包括γ干擾素（IFN－γ）、肝細胞生長因子、IL－1β、IL－6、IL－10、IL－23、IL－13、IL－18血管內皮生長因子（VEGF）［2330］。這些細胞因子的表達受到大量可變的上游調控者的控制，下游方面，這些因子影響多種分子的表達，在缺血損傷過程中要么起到保護作用，要么起到破壞作用。

小結：IRI的病理生理機制是一個多組織器官、多種因素、多種學科交叉關聯(lián)并相互制約的復雜過程，氧化應激反應、代謝障礙、細胞凋亡、活化細胞釋放炎癥介質等被認為參與其主要過程，但仍存在許多未知因素；肝臟是體內產生細胞因子的主要器官，也是諸多細胞因子作用的靶器官之一，HIRI可嚴重影響肝臟術后功能，甚至出現不可逆的損傷，進而出現多器官功能障礙的級聯(lián)反應；針對HIRI的防治方法多種多樣，如自由基清除劑、蛋白酶抑制劑、NO、鈣通道阻滯劑、中醫(yī)中藥、缺血預處理等，但尚無一種完備的措施，目前多種防治措施的聯(lián)合應用已經在臨床實驗中取得了良好的保護效果。因此，進一步探尋IRI的發(fā)生機制及并據此研制出更有針對性的防治措施將對未來肝臟外科的發(fā)展起到至關重要的作用。

［1］Gourab D，Barry J，Brian R，et al.Molecular mechanisms of liver ischemia reperfusion injury：insights from transgenic knockout models［J］.World J Gastroenterol，2013，19（11）：1683.

［2］Mahmoud AA，Shi YY，Niteen T，et al.Liver ischemia／reperfusion injury：processes in inflammatory networks－a review［J］.Liv－er transplantation，2010，16：1016.

［3］Zoratti M，Szabo I.The mitochondrial permeability transition［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1241：139.

［4］Lemasters JJ，Bunzendahl H，Thurman RG.Reperfusion injury to donor livers stored for transplantation［J］.Liver Transplant Surg，1995，1：124.

［5］Clemens MG，Bauer M，Pannen BHJ，et al.Remodeling of hepatic microvascular responsiveness after ischemia／reperfusion［J］.Shock，1997，8：80.

［6］Wang CY，Mathew WR，Guido DM，et al.Inhibition of nitric synthesis aggravates reperfusion injury after hepatic ischemia and endotoxemia［J］.Shock，1995，4：282.

［7］Shiraishi M，Hiroyasu S，Nagahama M，et al.Role of exogenous L－arginine in hepatic ischemia－reperfusion injury［J］.J Surg Res，1997，69：429.

［8］Nakamura S，Nishiyama R，Serizawa A，et al.Hepatic release of endothelin－1after warm ischemia［J］.Reperfusion injury and its hemodynamic effect［J］.Transplantation，1995，59：679.

［9］Urakami A，Todo S，Zhu Y，et al.Attenuation of ischemia liver injury by monoclonal anti－endothelin antibody，AWETN40［J］.J Am Coll Surg，1997，185：358.

［10］Koeppel TA，Kraus T，Thies JC，et al.Effects of mixed ETA and ETB－receptor antagonist（Ro－47－0203）on hepatic microcirculation after warm ischemia［J］.Dig Dis Sci，1997，42：1316.

［11］李佩東，關連越，李 巍.烏司他丁對肝缺血－再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.器官移植雜志，2013，4（2）：117.

［12］Brass CA，Roberts TG.Hepatic free radical production after cold storage：Kupffer cell－dependent and－independent mechanisms in rats［J］.Gastroenterology，1995，108（4）：1167.

［13］Zhou W，Zhang Y，Hosch MS，et al.Subcellular site of superoxide dismutase expression differentially controls AP－1activity and injury in mouse liver following ischemia／reperfusion［J］.Hepatology，2001，33：902.

［14］Wanner GA，Ertel W，Muller P，et al.Liver ischemia and reperfusion induces a systemic inflammatory response through Kupffer cell activation［J］.Shock，1996，5：34.

［15］Jaeschke H，Smith CW.Mechanisms of neutrophil－induced parenchymal cell injury［J］.J Leukoc Biol，1997，61：647.

［16］Kohli V，Selzner M，Madden JF，et al.Endothelial cell and hepatocyte deaths occur by apoptosis after ischemia－reperfusion injury in the rat liver［J］.Transplantation，1999，67：1099.

［17］Jaeschke H.Reperfusion injury after warm ischemia or cold storage of the liver：role of apoptotic cell death［J］.Transplant Proceedings，2002，34（7）：2656.

［18］Gujral JS，Bucci TJ，Farhood A，et al.Mechcanism of cell death during warm hepatic ischemia－reperfusion in rats：apoptosis or necrosis［J］.Hepatology，2001，33（2）：403.

［19］Redaelli CA，Tian YH，Schaffner T，et al.Extended preservation of rat liver graft by induction of heme oxygenase－1［J］.Hepatology，2002，35：1082.

［20］Peralta C，Fernandez L，Panes J，et al.Preconditioning protects against systemic disorders associated with hepatic ischemia－reperfusion through blockade of tumor necrosis factor induced P－selectin up－regulation in the rat［J］.Hepatology，2001，33：100.

［21］Schwabe RF，Brenner DA.Mechanisms of Liver Injury.TNF－alpha－induced liver injury：role of IKK，JNK，and ROS pathways［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290：G583.

［22］Rajesh M，Pan H，et al.Cannabinoid－2receptor agonist HU－308 protects against hepatic ischemia／reperfusion injury by attenuating oxidative stress，inflammatory response，and apoptosis［J］.J Leukoc Biol，2007，82：1382.

［23］Shen XD，Ke B，Zhai Y，et al.Absence of toll－like receptor 4（TLR4）signaling in the donor organ reduces ischemia and reperfusion injury in a murine liver transplantation model［J］.Liver Transpl，2007，13：1435.

［24］Oe S，Hiros T，Fujii H，et al.Continuous intravenous infusion of deleted form of hepatocyte growth factor attenuates hepatic ischemia－reperfusion injury in rats［J］.J Hepatol，2001，34：832.

［25］Zhai Y，Shen XD，Gao F，et al.CXCL10regulates liver innate immune response against ischemia and reperfusion injury［J］.Hepatology，2008，47：207.

［26］Matsumoto T，O’Malley K，Efron PA，et al.Interleukin－6and STAT3protect the liver from hepatic ischemia and reperfusion injury during ischemic preconditioning［J］.Surgery，2006，140：793.

［27］Husted TL，Blanchard J，Schuster R，et al.Potential role for IL－23in hepatic ischemia／reperfusion injury［J］.Inflamm Res，2006，55：177.

［28］Ke B，Shen XD，Lassman CR，et al.Cytoprotective and antiapoptotic effects of IL－13in hepatic cold ischemia／reperfusion injury are heme oxygenase－1dependent［J］.Am J Transplant，2003，3：1076.

［29］Takeuchi D，Yoshidome H，Kato A，et al.Interleukin 18causes hepatic ischemia／reperfusion injury by suppressing anti－inflammatory cytokine expression in mice［J］.Hepatology，2004，39：699.

［30］Tsuchihashi S，Ke B，Kaldas F，et al.Vascular endothelial growth factor antagonist modulates leukocyte trafficking and protects mouse livers against ischemia／reperfusion injury［J］.Am J Pathol，2006，168：695.

2015－03－28）

1007－4287（2015）09－1602－04

國家自然科學基金（81170416）；天普研究基金（01201046）；吉林省科技廳國際合作研究基金（2011742）；吉林省自然科學基金（201015178）

＊通訊作者