劉海英 潘秀麗 劉見橋

·實驗研究·

K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3凋亡作用機制的研究

劉海英 潘秀麗 劉見橋

目的 闡述K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O(FNdPW)誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3凋亡作用的機制。方法 MTT 法檢測細胞生長；吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)與電鏡檢測細胞形態(tài)；半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)活性試劑盒檢測Casapse-3的變化；Western Blot法檢測細胞中B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、多肽抗原(Bax)以及細胞色素C蛋白的表達。結(jié)果 FNdPW降低了卵巢癌SKOV3的細胞活力, IC50=3.56 μmol/L。FNdPW能夠使Bcl-2蛋白表達下調(diào), 促凋亡蛋白Bax表達上調(diào), 能夠增加Caspase-3的活性, 同時使細胞色素C表達上調(diào)。 結(jié)論 FNdPW通過促進卵巢癌細胞系SKOV3的凋亡,從而引起細胞增殖下降, 導(dǎo)致細胞死亡。為FNdPW可成為臨床卵巢癌患者的有效治療藥物提供了實驗依據(jù)。

K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O；多金屬氧酸鹽；卵巢癌；SKOV3；凋亡

K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O(FNdPW)是一種多金屬氧酸鹽［1］。卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤, 大多數(shù)在中晚期才發(fā)現(xiàn), 因此, 手術(shù)與化療是治療中晚期卵巢癌常用方法［2］。現(xiàn)階段采用的化療藥物有較強的副作用, 因此新的副作用小的抗癌藥物越來越多的被廣大專家學(xué)者所重視。關(guān)于多金屬氧酸鹽抗腫瘤研究很多, 但其抗腫瘤的機制并未有相應(yīng)的文獻報道, 本實驗證明了FNdPW誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3的凋亡的機制, 從而為多金屬氧酸鹽在卵巢癌的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ), 也為多金屬氧酸鹽抗腫瘤提供更多科學(xué)的依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV3由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)贈送, 用RPM I-1640 (含10%小牛血清) 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)?？笲CL-2、抗Bax以及細胞色素C單克隆抗體(美國Cell Signaling), K9(C4H4FN2O2)2Ce (PW11O39)2·23H2O由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院贈送, Caspase-3試劑盒(碧云天, 中國)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定SKOV3細胞生長抑制率 將1×108/L的SKOV3 細胞接種于6孔板中, 貼壁培養(yǎng)24 h后, 分別向培養(yǎng)細胞中加入不同濃度的FNdPW, 使終濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L。以5×107/L濃度接種SKOV3于96孔板, 每組設(shè)定6個平行孔, 并設(shè)定空白對照。細胞貼壁培養(yǎng)24 h后, 分別加入上述不同濃度的藥物, 測定作用時間為24 h后細胞的吸光度(A570 )。

1.2.2 Caspase-3活性檢測試劑盒的檢測 將各組細胞收集到離心管中, 1500 rpm, 4℃ 離心5 min收集細胞, 棄去上清, PBS 洗滌1次, 離心, 再次吸盡上清, 加入50 μl裂解液, 重懸沉淀, 混勻, 冰裂解15 min。4℃ 13500 rpm離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的1.5 ml離心管中。立即按Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書測定 Caspase-3的酶活性,同時可以取少量樣品用 Bradford 法測定蛋白濃度

1.2.3 AO/EB染色法檢測細胞生存 ①將SKOV3細胞培養(yǎng)于滅菌的玻片上24 h。②將FNdPW 4.0 μmol/L 加入到細胞中24 h。③PBS洗2次, 加入AO-EB混合液染色(100 mg/ml的AO 以及 100 mg/ml的EB融于PBS中［3］。④用熒光顯微鏡檢測細胞形態(tài)的變化(×100) ［原理：吖啶橙(AO)能穿透細胞膜完整的細胞, 嵌入細胞核DNA, 使其發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠(EB)只能透過胞膜受損的細胞, 嵌入細胞核DNA后使之發(fā)橘紅色熒光。非凋亡細胞核熒光顏色深淺不一, 大多數(shù)呈現(xiàn)綠色。凋亡的細胞染色增強, 熒光更為明亮,呈現(xiàn)均勻一致的團塊狀、圓狀或固縮狀結(jié)構(gòu), 大多數(shù)呈現(xiàn)淡黃色。而壞死細胞多半呈現(xiàn)形狀不一的紅色］。細胞凋亡率用以下公式檢測：凋亡率=凋亡的細胞/所有細胞的總和×100%。

1.2.4 Western Blot分析蛋白質(zhì)的提取 PBS漂洗各組細胞2次, 4℃、5000 r離心10 min, 收集細胞, 加入裂解液60 μl(RIPA：蛋白酶抑制劑=1∶100), 冰上超聲(60 Hz)打碎, 10 min/次, 13500 r離心15 min吸上清。BCA法測蛋白濃度。80 μg總蛋白質(zhì)濃度在8%~10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后, 轉(zhuǎn)移至NC膜, 然后將膜置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉2 h后, PBS沖洗。加入Bcl2和Bax一抗(1∶1000)以及細胞色素C(1∶250)4℃過夜。用PBS-T緩沖液洗膜3次, 15 min/次, 然后用紅外熒光標記二抗(1∶10000)對膜室溫孵育1 h后, 用PBS-T沖洗NC膜3次, 10 min/次。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料用均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料用率(%)表示, 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FNdPW對SKOV3細胞存活率的影響 不同濃度的FNdPW(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)作用24 h后, 應(yīng)用MTT方法檢測細胞活性, 結(jié)果顯示, 與對照組相比, SKOV3的生長均受到不同程度的抑制。并計算IC50為3.56 μmol/L (n=3, *P<0.05)。因此在后續(xù)實驗, 采用FNdPW劑量為4.0 μmol/L作用24 h為實驗條件。見圖1。

圖1 FNdPW抑制SKOV-3增殖。MTT法檢測細胞活力, 每組n=3(P<0.05 vs.Ctrl.)

2.2 FNdPW誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡 細胞的活力變化是其增殖和凋亡的動態(tài)平衡過程［4］。圖2A是熒光顯微鏡分析得到是結(jié)果。在熒光顯微鏡下可觀察到三種類型的細胞：活細胞(綠色), 凋亡細胞(黃色), 壞死細胞(紅色)。結(jié)果顯示FNdPW能誘導(dǎo)細胞凋亡 (P<0.05)。圖2B顯示在加入FNdPW后, 細胞高微結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。在10000倍視野下觀測到細胞表面絨毛減少, 細胞核染色質(zhì)凝聚, 細胞核固縮, 邊膜起泡等現(xiàn)象, 是典型的細胞凋亡特征。見圖2。

圖2 圖2A, AO/EB染色檢測細胞核的變化。以數(shù)理統(tǒng)計的方法,統(tǒng)計細胞凋亡率。圖2B透射電鏡用以評估細胞高微結(jié)構(gòu)的變化(放大倍數(shù)：10, 000×)。(*P<0.05 vs.Ctrl.)。AO/EB染色中細胞的凋亡率用統(tǒng)計條形圖表示(*P<0.05 vs.Ctrl)

2.3 FNdPW對SKOV3細胞中Bcl-2、Bax以及細胞色素C蛋白的影響 將FNdPW (4.0 μmol/L, 24 h)加入SKOV3細胞中, 應(yīng)用Western Blot方法檢測Bcl-2、Bax與細胞色素C蛋白的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組相比, 經(jīng)FNdPW處理的SKOV3細胞中Bax與Bcl-2蛋白的比值顯著升高(n=3, *P<0.05), 同時細胞色素C蛋白的表達顯著上調(diào)(n=3, *P<0.05)。見圖3A, 見圖3B。

圖3 Western blotting 方法檢測, Bax, Bcl-2(A)和 細胞色素C (B)蛋白的變化GAPDH為這幾個蛋白的內(nèi)參, 平均光密度值用統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表示, 每組n=3。 (C)Caspase-3試劑盒檢測FNdPW作用后Caspase-3 活性的表達變化, 數(shù)據(jù)統(tǒng)計用條形圖表示, 圖3C為3次實驗的統(tǒng)計結(jié)果

2.4 FNdPW對Caspase-3活性的影響 FNdPW誘導(dǎo)的SKOV3細胞凋亡是否為依賴Caspase途徑, 對SKOV3細胞進行Caspase-3活性檢測, 實驗組為加SKOV3 (4.0 μmol/L, 72 h)處理組, 對照組為不經(jīng)任何處理的空白組。用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測, 發(fā)現(xiàn)FNdPW誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡時, Caspase-3活性顯著增加(n=3, P<0.05), 說明FNdPW誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡是依賴于Caspase-3的活化。見圖3C。

3 討論

FNdPW是一種多金屬氧酸鹽, 相關(guān)的文獻證明FNdPW能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［1］。但國內(nèi)外尚未有報導(dǎo)證明FNdPW對卵巢癌細胞SKOV3的增殖作用。本實驗通過MTT實驗方法篩選了不同濃度FNdPW對卵巢癌細胞株SKOV-3的細胞凋亡作用。通過檢測分析發(fā)現(xiàn)在加入FNdPW后, 與不加藥的對照組比較, FNdPW能明顯改變 SKOV-3的細胞活性。其中IC50=3.56 μmol/L。在此濃度下, 分別通過AO/EB染色與電鏡實驗觀察了加入FNdPW后細胞的變化, 發(fā)現(xiàn)在加入FNdPW(4.0 μmol/L, 24 h)SKOV3細胞發(fā)生了明顯的凋亡。之后通過western blot方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白, Bcl-2、Bax的變化。作者發(fā)現(xiàn)與對照組比較, FNdPW(4.0 μmol/L, 24 h)能夠增加Bax/ Bcl-2的比值(而Bax/ Bcl-2的比值是檢測細胞凋亡的金標準［5］)。之后檢測了細胞色素C蛋白的變化, 發(fā)現(xiàn)在加入FNdPW后, 能夠明顯的上調(diào)細胞色素C。從而活化Caspase-3途徑誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡?；诒狙芯康膶嶒灲Y(jié)果及已證實的相關(guān)結(jié)果推測, FNdPW是通過通過線粒體凋亡途徑產(chǎn)生凋亡, FNdPW是通過降低細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達, 進而升高Bax蛋白, 使細胞色素C表達升高, 從而激活Caspase-3, 使其水解產(chǎn)生酶解級聯(lián)反應(yīng), 最后導(dǎo)致SKOV3細胞凋亡。

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［2］ Siegel R, Desantis C, Jemal A.Colorectal cancer statistics, 2014.CA Cancer J Clin, 2014, 64(2):104-117.

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Research of mechanism by K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O for inducing SKOV3 apoptosis in ovarian cancer

LIU Hai-ying, PAN Xiu-li, LIU Jian-qiao.
Center for Reproductive Medicine, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, China

Objective To illustrate the mechanism of K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O (FNdPW) for inducing SKOV3 apoptosis in ovarian cancer.Methods Cell growth was detected by MTT method, and cellular morphology was detected by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and electron microscope.Cysteinyl aspartate specific proteinase (Caspase-3) active kit was applied for detecting Caspase-3 changes, and Western Blot method was applied in detection of expressions of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and Bcl-2 Assaciated X protein (Bax) in cell and cytochrome C protein.Results FNdPW decreased viability of SKOV3 in ovarian cancer, IC50=3.56 μmol/L.FNdPW had capacity for decreasing expression of Bcl-2 protein, and increasing expression of apoptin Bax and cytochrome C, along with viability of Caspase-3.Conclusion Necrocytosis is induced by FNdPW through its accelerating SKOV3 apoptosis in ovarian cancer for decreased cell proliferation.That provides experimental reference for applying FNdPW for effective drug in clinical treatment of ovarian cancer patients.

K9(C4H4FN2O2)2Ce(PW11O39)2·23H2O; Polyoxometallate; Ovarian cancer; SKOV3; Apoptosis

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.13.180

2015-04-09］

510150 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(劉海英 劉見橋)；牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院臨床技能中心(潘秀麗)