白 雪,姜愛(ài)麗,*,胡文忠,何煜波,馮 可

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

采后藍(lán)莓果實(shí)表面病原菌的分離鑒定及PCR檢測(cè)

白 雪1,姜愛(ài)麗1,*,胡文忠1,何煜波1,馮 可2

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

以采后貯藏過(guò)程中自然腐敗變質(zhì)的藍(lán)莓果實(shí)為材料,采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和平板劃線法對(duì)藍(lán)莓果實(shí)表面致腐優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了分離與形態(tài)學(xué)鑒定,最終確定葡萄孢霉(Botrytiscinema)為主要病原菌。采用基因組DNA提取試劑盒法提取葡萄孢霉的DNA,并篩選具有特異性的引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)葡萄孢霉特定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到具有特異性的目的基因,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)的特異性鑒定,并對(duì)其檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終得到具有特異性的引物序列為BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAATTGTTGC,最適的擴(kuò)增引物濃度為0.25 μmol/L,PCR擴(kuò)增的最適退火溫度為 60 ℃。該方法可有效提高藍(lán)莓病原菌的檢測(cè)效率,可將其應(yīng)用于實(shí)踐中,為藍(lán)莓的貯藏保鮮提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

藍(lán)莓,病原菌,葡萄孢霉,PCR檢測(cè),分離鑒定

藍(lán)莓甜酸適口,營(yíng)養(yǎng)成分豐富,是世界糧農(nóng)組織推薦的五大健康水果之一,其富含熊果甙、花青素等其他果品中少有的營(yíng)養(yǎng)成分,果實(shí)制品具有延緩老化[1]提高抵御DNA損傷[2],解除眼睛疲勞并提高視力,增強(qiáng)心臟功能[3]等多方面的功效。

藍(lán)莓貯藏過(guò)程中的腐爛現(xiàn)象一直是制約藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題,而藍(lán)莓果實(shí)病原菌的侵染又是導(dǎo)致其腐爛的最主要原因。目前,相關(guān)藍(lán)莓病原菌的研究大都是對(duì)其主要病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的初步分類與鑒定,而對(duì)其病原菌進(jìn)行特異性分子生物學(xué)鑒定的研究很少。葡萄孢霉(Botrytis cinema)又稱灰霉菌[4],是危害花卉、水果、蔬菜等多種經(jīng)濟(jì)作物的優(yōu)勢(shì)病原菌,經(jīng)Hahn等[5]和陳長(zhǎng)卿等[6]研究發(fā)現(xiàn)引起采后藍(lán)莓腐敗變質(zhì)的主要病原菌是葡萄孢霉,馮璐等[7]和Sanzani等[8]也采用傳統(tǒng)的方法對(duì)葡萄孢霉進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的初步分離與鑒定,但并未對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)層面的鑒定。

大連地區(qū)是栽培藍(lán)莓的主產(chǎn)區(qū),近年來(lái)鮮食藍(lán)莓的產(chǎn)量逐年上升。盡管Hahn等[5]和陳長(zhǎng)卿等[6]研究發(fā)現(xiàn)引起采后藍(lán)莓腐敗變質(zhì)的主要病原菌是葡萄孢霉,但大連地區(qū)主栽藍(lán)莓品種的病原菌種類和防治方法未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本研究不僅對(duì)引起大連地區(qū)鮮食藍(lán)莓主栽品種腐敗變質(zhì)的病原菌進(jìn)行了分離,還對(duì)其進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定,分離到葡萄孢霉為主要病原菌。而且對(duì)葡萄孢霉的特異性進(jìn)行鑒定,并進(jìn)一步對(duì)其PCR鑒定條件進(jìn)行優(yōu)化,確保得到更清晰快速的檢測(cè)結(jié)果,為藍(lán)莓采后保鮮及病原菌的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓果實(shí) 大連南北藍(lán)莓科技發(fā)展有限公司藍(lán)莓園,500 g為一個(gè)樣本,取10個(gè)樣本。采后立即運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室,4 ℃貯藏備用。葡萄糖,瓊脂粉 國(guó)產(chǎn)分析純;DNA植物kit基因組織提取試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司。

DYY-11型電泳儀電源、DYCP-31F型電泳儀 北京市六一儀器廠;TC-512型PCR儀 Techne公司;BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;BR4i型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan公司;超凈工作臺(tái)2HJH-C2112B 上海智城分析儀器制造有限公司。

依據(jù)Celik M[9]、Gachon C[10]的研究,實(shí)驗(yàn)所需兩對(duì)引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成,配對(duì)引物序列:BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAATTGTTGC;FHel81-AC AGACTTTGGGCACATTCC,RHel82-TGTAATTTCAA TGTGCAGAATCC。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化 用混菌法分離病原菌,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5CFU/mL各個(gè)梯度稀釋的菌液,放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出,用平板劃線法,連續(xù)培養(yǎng)3～5次,使其在培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落,從而達(dá)到對(duì)藍(lán)莓表面病原菌進(jìn)行分離純化的目的[11]。

1.2.2 回接實(shí)驗(yàn) 將分離純化得到的病原菌回接到無(wú)病蟲害的新鮮藍(lán)莓上,參照范青等[12]的方法:將新鮮、無(wú)病害、無(wú)機(jī)械傷的藍(lán)莓用酒精消毒,晾干后,用滅菌鐵釘在每個(gè)果實(shí)腰部刺孔(3 mm深×3 mm寬),在孔內(nèi)接種一定濃度(3×106CFU/mL,0.1 mL)的菌液,將接種后果實(shí)放入經(jīng)紫外燈照射30 min的塑料托盤中,薄膜包裝后放在25 ℃下保濕培養(yǎng),定期觀察發(fā)病狀態(tài)。

1.2.3 病原菌DNA的提取 用寶生物工程(大連)有限公司提取試劑盒提取。

1.2.4 引物篩選 在體系中分別加入兩種引物,在各自所需條件下進(jìn)行PCR反應(yīng),觀察結(jié)果。

1.2.5 PCR反應(yīng)體系中引物濃度優(yōu)化 選取已經(jīng)篩選成功的PCR反應(yīng)的特異性引物,作為工作液。PCR體系主要包括:每50 μL PCR反應(yīng)液中Ex Taq酶(5 U/μL)0.3 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)5 μL,MgCl2(25 mmol/L)的加入量為4 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)的加入量是4 μL,模板DNA溶液的加入量是3 μL,篩選出的具有特異性的上下游引物,依據(jù)先前致腐菌PCR實(shí)驗(yàn)的研究比對(duì),采用較為合適的實(shí)驗(yàn)方法[13],引物濃度分別為1,0.4,0.25,0.2,0.15 μmol/L。上下游引物添加量分別為1 μL,將剩余體系體積用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為:預(yù)變性溫度95 ℃,時(shí)間持續(xù)2 min;變性的溫度是94 ℃,時(shí)間15 s,60 ℃退火15 s,整個(gè)過(guò)程重復(fù)35次,延伸溫度是72 ℃,時(shí)間10 min,產(chǎn)物4 ℃保存[14-15]。

1.2.6 PCR反應(yīng)體系中退火溫度的優(yōu)化 選取已經(jīng)篩選成功的PCR反應(yīng)特異性引物,按照優(yōu)化后的引物濃度,每50 μL PCR反應(yīng)體系中加入 Ex Taq 酶(5 U/uL)0.3 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)5 μL,MgCl2(25 mmol/L)的加入量為4 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)的加入量是4 μL,模板DNA溶液的加入量是3 μL,上下游引物各1 μL,將剩余體積用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為:預(yù)變性溫度95 ℃,時(shí)間持續(xù)2 min;變性的溫度是94 ℃,時(shí)間15 s,退火溫度53 ℃[16-17],并設(shè)置梯度退火實(shí)驗(yàn),55、60、65 ℃進(jìn)行退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn),退火時(shí)間15 s,整個(gè)過(guò)程重復(fù)35個(gè)循環(huán),延伸溫度是72 ℃,時(shí)間10 min,產(chǎn)物4 ℃保存[18]。

1.2.7 PCR產(chǎn)物電泳分析 PCR體系反應(yīng)結(jié)束后,從獲得的體系中分別取出體積為10 μL的PCR產(chǎn)物,并將0.5 g瓊脂糖粉末倒入50 mL的TAE緩沖液中,同時(shí)加入GelRed染料,煮開兩次,得到濃度為1%的膠版,將電泳條件設(shè)定為電壓U=95 V,電流I=400 mA,時(shí)間T=1 h,整個(gè)電泳過(guò)程結(jié)束后,經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落分離純化結(jié)果

按梯度稀釋法獲得的結(jié)果,通過(guò)平板劃線法得到單菌落,培養(yǎng)后僅得到一種優(yōu)勢(shì)菌株,依據(jù)其培養(yǎng)基狀態(tài)特征,判斷其類別,并采用插片鑒定法[19]進(jìn)行形態(tài)鑒定。

分離到的病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(圖1):菌落呈絨狀,菌絲體初為白色,后形成灰色霉層,而顯微鏡下觀察到孢子梗頂端不膨大,排列成帚狀的間枝,分生孢子串呈不分枝的鏈狀(圖2)。

圖1 病原菌在培養(yǎng)基狀態(tài)Fig.1 Pathogens on PDA

圖2 病原菌在顯微鏡下狀態(tài)Fig.2 Pathogens in the microscope

通過(guò)與真菌鑒定手冊(cè)[20]所描述的形態(tài)比對(duì),發(fā)現(xiàn)此真菌菌落特征與葡萄孢霉的特點(diǎn)相符,初步判定是葡萄孢霉。

2.2 回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回接實(shí)驗(yàn)證明,病原菌對(duì)藍(lán)莓果實(shí)具有很強(qiáng)的致病性,基本確定其為葡萄孢霉。

圖3 病原菌回接實(shí)驗(yàn)Fig.3 Pathogen infection experiment

2.3 PCR引物篩選結(jié)果

由圖4反應(yīng)結(jié)果可知,特異性引物BcF-TGTAA TTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TGAAATGCGATTAA TTGTTGC擴(kuò)增出特定的大小為90 bp的目的基因;FHel81-ACAGACTTTGGGCACATTCC,RHel82-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC未獲得特異性的PCR產(chǎn)物,所以引物BcR/BcF具有特異性,BcR/BcF這一對(duì)特異性引物可以作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)引物。

圖4 PCR引物篩選結(jié)果Fig.4 The different primer of PCR amplification products注:M:Maker500;1～2:BcR/BcF引物擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果;3～4:FHel81/FHel82引物擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果。

圖5 相對(duì)遷移率與目的基因?qū)?shù)相關(guān)性關(guān)系Fig.5 Relationship between relative mobility and genes size

由于目的基因太小,沒(méi)有小于100 bp的maker與之匹配,所以通過(guò)相對(duì)遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)驗(yàn)證所獲得的目的基因的大小。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比,得到目的基因的大小為90 bp。

2.4 PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果

引物濃度為1 μmol/L和0.4 μmol/L的PCR反應(yīng)結(jié)果類似,幾乎看不到目的基因,引物濃度為0.2 μmol/L和0.15 μmol/L的PCR反應(yīng)結(jié)果類似,目的基因不太清晰。實(shí)驗(yàn)中引物濃度為0.25 μmol/L的PCR反應(yīng)結(jié)果較為清晰,特異性更強(qiáng),這一體系添加標(biāo)準(zhǔn)可以被用于繼續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。

圖6～圖8分別是引物濃度為0.4,0.2,0.25 μmol/L的PCR反應(yīng)結(jié)果。

圖6 PCR引物濃度為0.4 μmol/L的結(jié)果Fig.6 PCR results of Primer diluted to 1 μmol/L注:M:Marker500;1～3:擴(kuò)增結(jié)果，圖7、圖8同。

圖7 PCR引物濃度稀釋為0.2 μmol/L的結(jié)果Fig.7 PCR results of Primer diluted to 0.2 μmol/L

圖8 PCR引物濃度稀釋為0.25 μmol/L的結(jié)果Fig.8 PCR results of Primer diluted to 0.25 μmol/L

2.5 PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

圖9是退火溫度為53 ℃的PCR反應(yīng)結(jié)果,圖10是退火溫度為55、60、65 ℃的梯度退火PCR反應(yīng)結(jié)果,圖9幾乎看不到特異性引物BcR/BcF擴(kuò)增出的目的基因。圖10中可以看出最合適的退火溫度為60 ℃。

圖9 PCR退火溫度為53 ℃的結(jié)果Fig.9 Annealing temperature 53 ℃ results注:M:Maker500;1～3:53 ℃結(jié)果。

圖10 PCR梯度退火的結(jié)果Fig.10 Annealing temperature result注:M:Maker500;1～3:60 ℃,4～6:65 ℃,7～9:55 ℃。

3 結(jié)論與討論

果實(shí)成熟后感染葡萄孢霉會(huì)導(dǎo)致其在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中大量腐爛,嚴(yán)重影響其采后保鮮。對(duì)于藍(lán)莓而言,從源頭發(fā)現(xiàn)染病果實(shí)并及時(shí)挑選處理對(duì)減少其貯藏?fù)p失尤為重要。本實(shí)驗(yàn)分離篩選出的引起采后藍(lán)莓腐敗變質(zhì)的主要病原菌為葡萄孢霉,采用PCR技術(shù)對(duì)葡萄孢霉進(jìn)行了特異性分子生物學(xué)鑒定,并對(duì)其鑒定條件及操作方法進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到最具特異性的引物序列為BcF-TGTAATTTC AATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAA TTGTTGC,最合適的引物濃度為0.25 μmol/L,最合適的退火溫度為60 ℃。

本研究利用了PCR技術(shù),建立了一種敏感準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,利用PCR技術(shù)對(duì)藍(lán)莓表面病原菌進(jìn)行檢測(cè),可以使其病原菌DNA得以迅速擴(kuò)增,靈敏度高、省時(shí)有針對(duì)性,利用在實(shí)際中可以大大提高檢測(cè)的效率及準(zhǔn)確率,本方法為今后藍(lán)莓采后貯藏提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ),具有較好的應(yīng)用前景。

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Study on the optimization of PCR detection conditions for pathogen isolated from the postharvest blueberry surface

BAI Xue1,JIANG Ai-li1,*,HU Wen-zhong1,HE Yu-bo1,FENG Ke2

(1.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The main pathogens were separated and identified from the rotting postharvest blueberry fruits using traditional pure culture method and plate streaking method. The results showed that the main pathogen wasBotrytiscinerea. In order to identifyBotrytiscinereawith PCR method and found its best experimental conditions,the Genomic DNA was extracted and the target gene was screened with specific primers. The optimum PCR experimental condition was as following:the primer sequences were BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC and BcR-TTGAAATGCGATTAATT GTTGC,the best amplification primer concentration was 0.25 μmol/L,the optimal annealing temperature was 60 ℃. This PCR method could effectively improve the detection efficiency of blueberry pathogens. Moreover,it helped to set up a theoretical basis and technical guidance for the preservation of blueberries in production.

blueberry;pathogen;Botrytiscinerea;PCR detection;isolation and identification

2015-03-27

白雪(1991-)，女，本科，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:597764245@qq.com。

*通訊作者:姜愛(ài)麗(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:jal@dlnu.edu.cn。

國(guó)家國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2013DFA31450)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)23-0297-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.053