秦西平，潘洪玉，徐芝龍，程風(fēng)春

(1.臨沂市蘭陵縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 277799；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

檢測高爾基體蛋白73及其基因表達(dá)對原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值

秦西平1，潘洪玉1，徐芝龍1，程風(fēng)春2

(1.臨沂市蘭陵縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 277799；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

目的：探討高爾基體蛋白73(GP73)血清及其基因表達(dá)在原發(fā)性肝癌(PHC)中的診斷價(jià)值，分析GP73在PHC診斷及高危人群普查的臨床意義。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)定量檢測85例PHC、46例肝硬變患者和102名健康人的血清GP73、AFP水平，計(jì)算GP73的敏感度、特異度和受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積，采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)法檢測各組外周血單個(gè)核細(xì)胞GP73 mRNA的相對表達(dá)量，以Ct值比較法計(jì)算GP73 mRNA相對表達(dá)水平，同時(shí)檢測12份正常肝組織和12份肝癌組織的GP73 mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果：PHC組和肝硬變組患者的GP73中位血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為295.6 μg/L、213.9 μg/L，PHC組GP73中位血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)較肝硬變組明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)。PHC組和肝硬變組患者的AFP中位血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.6 μg/L、7.0 μg/L，無顯著性差異(P>0.05)。GP73診斷肝癌的敏感度(72.7%)高于AFP(49.8%)，有顯著性差異(P<0.05)，GP73特異度(70.8%)低于AFP(95.9%)，有顯著性差異(P<0.05)。GP73和AFP聯(lián)合檢測肝癌的敏感度為79.6%，特異度為80.3%，ROC曲線下面積為0.840(95% CI為0.770～0.919)；全血GP73 mRNA含量3組間無顯著性差異(P>0.05)，肝癌組織GP73 mRNA表達(dá)量(12.87)明顯高于正常肝組織(1.08)，有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：GP73診斷PHC具有較好的敏感度，GP73與AFP聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷早期肝癌的敏感度。全血標(biāo)本GP73 mRNA檢測不能作為診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志，肝組織標(biāo)本GP73 mRNA可為診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志，但存在創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)大等弊端。血清GP73聯(lián)合AFP檢測可顯著提高PHC診斷，二者聯(lián)合可用于PHC高危人群的普查及篩選。

原發(fā)性肝癌；高爾基體蛋白73；甲胎蛋白；基因

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高，5年總體生存率不大于10%[1]。世界上每新增加10例PHC患者，就有一半發(fā)生在中國[2]。大多數(shù)PHC患者有肝硬變等肝臟疾病史，發(fā)病初期可能沒有任何癥狀，明確診斷時(shí)多已是中晚期，且常伴有其他部位的轉(zhuǎn)移，治療效果極差。因此，尋求肝癌的早期診斷方法尤為重要。甲胎球蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)長期以來被認(rèn)為是診斷PHC最有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，但在PHC發(fā)展的早期階段其敏感度較低。GP73是高爾基體Ⅱ型跨膜蛋白，健康人群可有表達(dá)，但含量極低，但在肝硬變和PHC患者中，血清GP73表達(dá)顯著升高[3-4]。所以有報(bào)道認(rèn)為，血清GP73可能成為肝癌早期診斷的重要方法[4]。然而肝癌患者GP73基因表達(dá)水平如何，血清GP73與AFP聯(lián)合檢測對診斷PHC有何意義，這些問題尚不明確。本研究通過檢測早期肝癌、肝硬變患者血清GP73水平及外周血、部分肝癌組織的GP73 mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步評價(jià)對GP73、GP73 mRNA與AFP聯(lián)合檢測PHC的效能。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集2012年11月至2014年1月蘭陵縣人民醫(yī)院明確診斷的PHC患者和肝硬變患者作為研究對象。(1) PHC組85例，其中：男69例，女16例；年齡60.5±10.4歲。肝癌診斷符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[5]。(2)肝硬變組46例，其中：男39例，女7例；年齡59.6±11.2歲。肝硬變診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]中肝硬變診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選取門診健康體檢者102例作為對照組，其中：男78例，女24例；年齡56.3±9.2歲。另同期收集確診PHC并進(jìn)行肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織及尸檢的非醫(yī)源性正常肝組織各12份。各組年齡、性別無顯著性差異(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 抽取待檢者清晨空腹靜脈血6 mL，取3 mL加入抗凝劑試管中，室溫靜置1 h，隨后1 000 r/min離心10 min，分離血清后置-40℃冰箱保存，用于檢測GP73蛋白和AFP。取3 mL血清置EDTA抗凝劑的試管中，用于提取單個(gè)核細(xì)胞的RNA。RNA提取在6 h內(nèi)完成。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 應(yīng)用25 μL PCR體系，PCR上游引物(10 μmoL/L)1.6 μL、PCR下游引物(10 μmoL/L)1.6 μL、DNA模板2 μL、滅菌蒸餾水4.8 μL。反應(yīng)條件：首先94 ℃預(yù)變性 5 min，然后94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s開始循環(huán)，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 PT-PCR檢測GP73 mRNA 從GenBank中獲取GP73基因，應(yīng)用Primer Express軟件分析基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)[7]提供的引物設(shè)計(jì)原則，在這些序列的保守區(qū)域篩選1對引物。GP73上游引物序列為5’-CAGCGCTGATTGAGATGA-3’，下游引物序列為5’-ATGATCGTGTCTGGAGGTC-3’，目的基因長度為153 bp。β-actin上游引物序列為5’-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3’，下游引物序列為5’-GTGTTGGCGTACAGGTCTITG-3’，目的基因長度為459 bp。

1.5 檢測結(jié)果判斷 以GP73 mRNA與β-actin檢測Ct值之差(⊿Ct)作為評價(jià)GP73 mRNA相對表達(dá)水平的指標(biāo)。靶基因GP73 mRNA的相對量按公式靶基因=2-⊿⊿Ct計(jì)算，其中⊿⊿Ct =⊿Ct(Q)-⊿Ct(C)，⊿Ct(Q)為疾病組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差；⊿Ct(C)為對照組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用中位數(shù)(4分位數(shù))M(95%可信區(qū)間)表示。多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(Bonferroni校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)后調(diào)整為0.05)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)計(jì)算臨界值、敏感度、特異度和ROC曲線下面積。各組織標(biāo)本中的GP73 mRNA表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清GP73、AFP、GP73 mRNA檢測 結(jié)果詳見表1。

表1 各組GP73、AFP及GP73 mRNA檢測結(jié)果比較[M(95%可信區(qū)間)]

注：1)與PHC組GP73比較P<0.05

PHC組血清GP73中位質(zhì)量分?jǐn)?shù)較肝硬變組明顯升高(P<0.05)；2組AFP中位血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性差異 (P>0.05)，但PHC組和肝硬變組GP73、AFP血清中位質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于健康對照組(P<0.05)；全血GP73 mRNA含量3組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 血清GP73、AFP診斷PHC的敏感度、特異度和受試者工作特征曲線(ROC曲線)比較 結(jié)果詳見表2。

表2 血清GP73、AFP和二者聯(lián)合檢測診斷PHC的效能比較

確定血清GP73和AFP診斷PHC的臨界值分別為181.3 μg/L和15.4 μg/L，GP73診斷肝癌的敏感度高于AFP(P<0.05)，GP73特異度低于AFP(P<0.05)。血清GP73和AFP聯(lián)合檢測肝癌的敏感度為79.6%，特異度為80.3%，ROC曲線下面積為0.840(95% CI為0.770～0.919)，與AFP的ROC曲線下面積比較無顯著性差異(P>0.05)，GP73、AFP診斷PHC的ROC曲線分別為0.751、0.726。

2.3 正常肝組織、肝癌組織GP73 mRNA表達(dá)量比較 結(jié)果詳見表3。

表3 肝癌組織與正常肝組織GP73 mRNA表達(dá)量比較

注：1)肝癌組織與正常肝組織比較t=8.490，P<0.01

肝癌組織GP73 mRNA表達(dá)量明顯高于正常肝組織 (P<0.01)。

3 討 論

近年來我國PHC的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，早期診斷和治療不僅可改善PHC患者的預(yù)后，也可以節(jié)省大量醫(yī)療資源。AFP是目前應(yīng)用最廣泛的診斷原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物，但其敏感度仍不夠理想，尋找肝癌早期階段新的血清腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床價(jià)值。國內(nèi)外研究表明，血清GP73在PHC診斷方面的敏感度優(yōu)于AFP，有望成為新型血清腫瘤標(biāo)志[8]。然而，目前大多數(shù)研究僅限于血清水平，有關(guān)GP73在PHC及肝臟疾病患者血漿中及肝癌組織中的mRNA表達(dá)量的研究較少。

GP73主要在膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，正常肝細(xì)胞表達(dá)很少甚至不表達(dá)。Block等[9]和Jiang等[10]研究表明血清GP73在PHC中可顯著升高，對PHC早期檢測有著良好的應(yīng)用前景。Zhou等[11]的一項(xiàng)Meta研究表明：血清GP73的敏感度為76%，稍優(yōu)于AFP的敏感度70%；特異度86%，稍低于AFP特異度89%；ROC曲線下面積0.88，稍優(yōu)于AFP的ROC曲線下面積0.86，但無顯著性差異。故認(rèn)為血清GP73與AFP對PHC的診斷性能無顯著差異，兩者聯(lián)合檢測的性能評價(jià)需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示PHC組血清GP73水平較健康對照組明顯升高，GP73診斷肝癌的敏感度高于AFP，但GP73的特異度低于AFP。提示血清GP73在肝硬變高危人群中診斷PHC具有較好的敏感度，但特異度相對較差，與上述報(bào)道[11]不相符。筆者認(rèn)為本研究結(jié)果與Zhou報(bào)道差異甚大的主要原因是在ROC曲線中對特異性要求過高，而忽視了靈敏度指標(biāo)。AFP檢測與GP73和AFP聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積無顯著性差異，提示AFP單項(xiàng)與聯(lián)合GP73檢測，對PHC的診斷效能相似。這與Zhou等[11]的報(bào)道相符合。但本研究結(jié)果顯示，GP73和AFP聯(lián)合檢測的敏感度高于GP73單項(xiàng)診斷，提示GP73與AFP聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高PHC患者診斷的敏感度。

本研究在檢測PHC患者血清GP73的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深一步探討各實(shí)驗(yàn)組血清GP73 mRNA的表達(dá)量及肝癌組織與正常組織GP73 mRNA的相對表達(dá)水平。我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，從Genbank中獲取GP73基因，應(yīng)用Primer Express軟件分析基因序列，對血清和肝癌組織標(biāo)本進(jìn)行GP73 mRNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示PHC患者GP73 mRNA在全血中的表達(dá)量很微弱，其含量與肝硬變、對照組比較無顯著性差異。所以全血GP73 mRNA檢測對PHC沒有診斷價(jià)值。這可能是因?yàn)镚P73 mRNA主要存在于肝癌細(xì)胞中，血液中幾乎很難檢測到。這與Tian等[12]的報(bào)道一致。我們通過對肝癌組織及正常肝組織GP73 mRNA水平對比發(fā)現(xiàn)，肝癌組織GP73 mRNA表達(dá)量明顯高于正常肝組織，其表達(dá)量大約是正常肝組織的13倍，提示肝癌組織GP73 mRNA表達(dá)量明顯升高，所以我們認(rèn)為肝組織GP73 mRNA檢測對PHC是一個(gè)較好的指標(biāo)。但是考慮肝組織取材難、創(chuàng)傷大、患者痛苦等弊端，使其應(yīng)用受限。

綜上所述，高爾基體蛋白73可作為一種新的診斷PHC標(biāo)志，具有較好的敏感度。全血標(biāo)本的GP73 mRNA指標(biāo)不能作為診斷PHC的腫瘤標(biāo)志，肝組織標(biāo)本GP73 mRNA檢測可作為診斷PHC的腫瘤標(biāo)志，但存在取材難等缺點(diǎn)，應(yīng)權(quán)衡利弊。血清GP73聯(lián)合AFP檢測，能有效提高早期PHC患者的診斷敏感度，為早期PHC診斷提供有效途徑，可應(yīng)用于PHC高危人群的普查及篩選。

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Value of Detecting Golgi Protein 73 in Plasma and Gene Expression for the Diagnosis of Primary Liver Cancer

QIN Xiping1, PAN Hongyu1, XU Zhilong1, CHENG Fengchun2

(1.Linyi Lanling People's Hospital,Shandong Linyi 277799,China; 2.The Hospital of Binzhou Medical College,Shandong Binzhou 256600，China)

Objective:To investigate the value of Golgi protein 73 (GP73) and gene expression in the diagnosis of hepatocellular carcinoma(PHC); to analyse the clinical significance of serum GP73 in diagnosis of PHC for screening of high-risk groups.Methods:Took enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) quantitative detection of serum GP73 and AFP levels in 85 cases of PHC, 46 patients with cirrhosis and 102 healthy people. Calculated the sensitivity, specificity, and receiver operating characteristic curve under GP73 area(area under the ROC curve), real-time quantitative(RT-PCR) was used to detect the relative expression of GP73 mRNA in mononuclear cells in peripheral blood in each group, GP73 mRNA relative expression levels were detected with ct value comparison method，simultaneously explored the 12 GP73 mRNA in normal liver tissue and the 12 HCC tissues relative expression levels.Results:Serum concentrations of GP73 median in PHC group and cirrhosis patients were 295.6 μg/L,213.9 μg/L.The GP73 median serum concentration difference between the two groups were statistically significant(P<0.05). The median serum AFP concentrations in patients with PHC and cirrhosis were 9.6 μg/L,7.0 μg/L.The serum AFP concentration difference between the two groups were no significant difference(P>0.05).GP73 diagnostic sensitivity of hepatocellular carcinoma (72.7%) was higher than the AFP(49.8%,P<0.05); GP73 specificity(70.8%) was lower than the AFP(95.9%,P<0.05).GP73 and AFP united detection sensitivity for hepatocellular carcinoma was 79.6%, specificity 80.3%;the area under the ROC curve was 0.849(95%CI of 0.770～0.919);whole blood GP73 mRNA showed no significant difference among the three groups(P>0.05),GP73 mRNA expression of hepatocellular carcinoma (12.87) was significantly higher than in normal liver tissue(1.08). Conclusion:GP73 in PHC has better diagnostic sensitivity,GP73 and AFP united detection can further improve the early diagnosis of liver cancer.GP73 mRNA detection in whole blood samples cannot be used as a diagnostic marker of primary liver cancer;liver tissue samples GP73 mRNA can be as tumor markers in the diagnosis of primary liver cancer,but have with trauma and risks.AFP serum GP73 united detection can significantly improve the diagnosis of PHC;their combination can be used to PHC screening in high-risk populations.

primary liver cancer;golgi protein 73;alpha-fetoprotein(AFP);gene

秦西平，xuqinxuqin1986@qq.com

R735.7 <[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A class="emphasis_bold">[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005

A DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20150918.1750.028.html

2015-01-16)