楊臣臣,龍飛燕,畢艷紅,李云龍,王 玨,禹文海,井申榮,黃 芬

云南省豬戊型肝炎病毒全基因組擴(kuò)增及進(jìn)化分析

楊臣臣,龍飛燕,畢艷紅,李云龍,王 玨,禹文海,井申榮,黃 芬

目的 對(duì)豬戊型肝炎病毒全長(zhǎng)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，分析其進(jìn)化關(guān)系，為HEV的感染性克隆研究奠定基礎(chǔ)。方法 利用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-nPCR)和RACE技術(shù)對(duì)豬糞便中HEV樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，利用DNAStar和MEGA4.0軟件進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果 RT-nPCR方法擴(kuò)增出HEV的 5段目的基因序列和RACE技術(shù)擴(kuò)增出HEV的 5′和3′端，序列比對(duì)結(jié)果正確，HEV全長(zhǎng)擴(kuò)增成功。同源性分析顯示其與新疆株(GU119961)同源性較高(96.1%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示該病毒屬于基因4型h亞型豬HEV。結(jié)論 HEV全基因組序列擴(kuò)增成功，為深入研究HEV奠定基礎(chǔ)。

豬戊型肝炎病毒；巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR；全長(zhǎng)基因組分析

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)，是一種經(jīng)腸道傳播，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的病毒性肝炎病原體[1]。HEV主要經(jīng)過(guò)糞-口途徑傳播，食用HEV污染的水源和食物是導(dǎo)致HEV暴發(fā)流行的主要原因[2-3]。戊型肝炎病毒對(duì)孕婦和胎兒危害尤為嚴(yán)重，極易造成胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，妊娠晚期感染HEV后死亡率高達(dá)25%[4-7]。我國(guó)1986-1988年新疆地區(qū)HEV大流行造成20多萬(wàn)人發(fā)病，死亡707人(孕婦414人)，是迄今為止世界上最大的HEV流行[8]。

根據(jù)HEV基因組全序列的差異，可以將戊型肝炎病毒不同毒株分為4個(gè)主要的基因型：基因1型、基因2型、基因3型和基因4型[9-10]。新發(fā)現(xiàn)的禽HEV與其他4種基因型差異較大，成為一種新的基因型，命名為禽HEV[11]。2009年Zhao等在家兔上分離到的HEV株與已知的4種HEV基因型和禽HEV同源性均較低，是一種能感染兔子的新HEV基因型[12]。而鼠HEV是在德國(guó)挪威大鼠體內(nèi)分離得到[13-14]。

云南省以旅游產(chǎn)業(yè)為主，流動(dòng)人口較大，衛(wèi)生條件相對(duì)落后，至今還保留著生食豬肉的風(fēng)俗，并且很多地方仍直接飲用不經(jīng)消毒處理的露天生水，這增加HEV的流行暴發(fā)的可能。但是到目前為止，關(guān)于云南省HEV的分子流行調(diào)查較少，僅有2009年李文貴等對(duì)昆明地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉產(chǎn)品中HEV的感染情況進(jìn)行過(guò)初步的調(diào)查[[15]。在2010年，我們對(duì)云南省農(nóng)村豬群中HEV的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在豬群中存在較高的HEV感染率(陽(yáng)性率為10.26%)[[16]。本文通過(guò)選取其中一株陽(yáng)性HEV樣本，進(jìn)行HEV的全基因組擴(kuò)增，并對(duì)其同源性和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，為后續(xù)HEV研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理 豬HEV糞便樣本，采用0.1% DEPC處理的PBS緩沖液(PBS緩沖液，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，pH7.2～7.4)重懸糞便樣本，離心力12 000 g離心15 min，收集上清，-80 ℃保存。

1.2 RT-nPCR法檢測(cè)HEV RNA 利用Trizol(Invitrogen)RNA提取試劑盒提取糞便上清總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。逆轉(zhuǎn)錄試劑采用TaKaRa公司AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-nPCR引物序列為人和豬HEV的兼并引物，可以擴(kuò)增人和豬HEV的所有序列，引物序列如表1[[17]。反應(yīng)參數(shù)為：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。利用合成cDNA進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增HEV衣殼蛋白ORF2區(qū)域部分片段(348 bp)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

1.3 HEV基因序列全長(zhǎng)擴(kuò)增 利用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)試劑盒提取HEV陽(yáng)性樣品(27#)總RNA，利用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒擴(kuò)增HEV的全基因組序列。全基因組序列分為5段進(jìn)行擴(kuò)增，F(xiàn)1片段大小為1 285 bp，F(xiàn)2片段大小為1 603 bp，F(xiàn)3片段大小為1 339 bp，F(xiàn)4片段大小為1 236 bp，F(xiàn)5片段大小為1 932 bp，引物序列如表1[1]。PCR反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min。PCR循環(huán)參數(shù)：35循環(huán)。HEV 5′和3′端分別采用5′-Full RACE Kit with ATP和3′-Full RACE Core set with PrimeScriptTMRTase試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，5′和3′端片段大小分別為501 bp和936 bp，反應(yīng)條件參照說(shuō)明書(shū)。具體為：外套95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；PCR循環(huán)參數(shù)：20循環(huán)；72 ℃延伸10 min。內(nèi)套：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；PCR循環(huán)參數(shù)：25循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。目的條帶膠回收純化后進(jìn)行克隆和測(cè)序。

cPrimersequence(5′?3′)ProductLength/bpReferenceS11AGGCTCCTGGCRTYACTACTGF11285[17]A12GCGGCACTGGGCRTAAAACTHEV?A3GAAAAGTCTGGCCGTGATTACF21603ThisstudyHEV?B2TCCTCAGTAATAGTAAGGGCHEV?C3GCCAGCCATAGCTTGGTTTGAAGF31339ThisstudyD3RCTGGAAGAATGTTATACGAGACACD4FATGGTGGAGAAAGGCCAGGATF41236ThisstudyER2GAAGGGGTTGGTTGGATGAATEF1TTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTF51932ThisstudyHEV31CAGGGAGCGCGGAACGCAGAAAAGA5′Race?A1GCAGTGARTARAGYGCAAYCCCHGTCT5′RACE501[17]5＂Race?A2CGRGCCATYGCCTCNGCRACATC3′Race?S1ACYACNACTGCTGCYACACGBTTYATGA3′RACE9363′Race?S2CTYTGTTYAAYCTTGCTGAYACGCTKCTCHEV1AATTATGCC(T)CAGTAC(T)CGG(A)GTTGHEVdetection348[16]HEV2CCCTTA(G)TCC(T)TGCTGA(C)GCATTCTCHEV3GTT(A)ATGCTT(C)TGCATA(T)CATGGCTHEV4AGCCGACGAAATCAATTCTGTC

1.4 HEV同源性和進(jìn)化分析 采用SeqMan軟件對(duì)HEV的5個(gè)片段和5′和3′RACE進(jìn)行拼接，HEV全基因組序列進(jìn)行Blast核苷酸序列比對(duì)分析，并提交GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(KJ155502)。采用DNAStar軟件和Megalign軟件對(duì)其分別進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。HEV基因型分析所采用的參照序列為：基因1型為NC001434和M80581；基因2型為M74506；基因3型為JN906975和AB089824；基因4型為GU206559。其中基因4型亞型分析采用的參照序列為：a亞型為AF117275和AJ344171；b亞型為AB124818和AJ344186；c亞型為AB082545；d亞型為AJ344181和AY596308；e亞型為AF324501；g亞型為AB108537；h亞型為JN542514和KF703731。

2 結(jié) 果

2.1 豬HEV RT-nPCR檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖1，目的片段和理論大小348 bp相一致。PCR產(chǎn)物連接 pMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，Blast分析顯示該病毒屬于基因4型豬HEV。

1～5：樣品編號(hào)；6：陰性對(duì)照；M：DL2000 marker

1-5: number of samples; 6: negative control; M: DNA Marker DL2000.

圖1 RT-nested PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of HEV gene fragment amplified by RT-nested PCR

2.2 豬HEV全長(zhǎng)基因組序列擴(kuò)增及分析 HEV全基因組序列分為5部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，5個(gè)目的片段和理論大小相一致，結(jié)果如圖2。HEV 5′和3′端擴(kuò)增結(jié)果與理論大小一致，如圖3。PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)Blast分析顯示結(jié)果正確，豬HEV全長(zhǎng)擴(kuò)增成功。HEV全基因組序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為KJ155502。

本實(shí)驗(yàn)分離的HEV病毒株基因組全長(zhǎng)為7 240 bp(除去Pol(A)部分)，GC含量為55%。5′端為1 bp-26 bp，開(kāi)放閱讀框1(ORF1)為27 bp-5 150 bp，開(kāi)放閱讀框2(ORF2)為5 147 bp-7 171 bp，開(kāi)放閱讀框3(ORF3)為5 175 bp-5 519 bp，3′端為7 172 bp-7 264 bp，其ORF1和ORF2有3個(gè)堿基的重疊， ORF3與和ORF2完全重疊。

1：F1片段2：F2片段3：F3片段4：F4片段；5：F5片段；6：陰性對(duì)照；M：DL2000 marker

1: F1 fragment; 2: F2 fragment; 3: F3 fragment; 4: F4 fragment; 5: F5 fragment; 6: negative control; M: DNA Marker DL2000.

圖2 豬HEV全長(zhǎng)基因組序列PCR擴(kuò)增

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of HEV complete sequences fragment amplified by PCR

1：5′RACE PCR；2：3′RACE PCR 3：陰性對(duì)照；M：DL2000 marker

1: 5′RACE PCR; 2: 3′RACE PCR; 3: negative control; M: DL2000 marker.

圖3 豬HEV基因組5′RACE和3′RACE PCR擴(kuò)增

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of HEV 5′RACE and 3′RACE sequences fragment amplified by PCR

2.3 豬HEV全長(zhǎng)基因組序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析 全長(zhǎng)基因組同源性分析顯示，該毒株與HEV 1型、2型、3型和4型的同源性為39.1%～96.1%。與2009年分離自新疆(GU119961)、武漢(GU188851)和2011年分離自南京(JQ740781)的同源性最高分別為96.1%、95.7%和95.5%；與1993年分離自墨西哥的人HEV(M74506，基因2型)同源性最低(39.1%)，如圖4。

基于HEV ORF2部分序列(348 bp)的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，本實(shí)驗(yàn)分離毒株(KJ155502)屬于基因4型h亞型豬HEV，與2011年分離自云南的豬HEV(JN613156)、2009年分離自新疆的豬HEV(GU119961)、2009年分離自武漢的豬HEV(GU188851)和2011年分離自南京的人HEV(JQ740781)親緣關(guān)系較近，如圖5。

圖4 HEV全基因組序列同源性分析(%)

圖5 HEV部分ORF2序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.5 Phylogenetic analysis base on HEV ORF2 partial sequence

3 討 論

豬HEV病毒是一種人獸共患病毒，豬是HEV的主要宿主，不衛(wèi)生的飲食習(xí)慣和人畜相互接觸都會(huì)引起HEV的傳播感染。近幾年，在中國(guó)，基因4型HEV已經(jīng)代替基因1型成為優(yōu)勢(shì)基因型[21]。本實(shí)驗(yàn)中分離的HEV病毒株全長(zhǎng)核苷酸序列與基因4型豬HEV的同源性最高，為84.4%～96.1%。該毒株與2011李文貴等分離自云南的基因4型h亞型豬HEV毒株(JN613156)同源性較最高[20]。同時(shí)李文貴等在云南豬群中還分離到HEV基因4型b亞型(JN613152)，這說(shuō)明在云南地區(qū)至少存在b和h兩種亞型。本實(shí)驗(yàn)分離的豬HEV毒株與新疆、武漢和南京等地的HEV同源關(guān)系較近，同屬于h亞型，這可能與云南省是一個(gè)旅游大省有關(guān)。因此，一旦出現(xiàn)HEV污染水源或食物，將可能會(huì)導(dǎo)致HEV的暴發(fā)流行。本次實(shí)驗(yàn)初步分析了云南省昆明地區(qū)豬HEV的序列特征，豐富了HEV進(jìn)化和分子流行病學(xué)的內(nèi)容，為HEV防治及HEV感染性克隆研究奠定基礎(chǔ)。

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Huang Fen, Email: huangfen6789@163.com

Amplification and evolution analysis on full-length genome of swine hepatitis E virus

YANG Chen-chen,LONG Fei-yan,BI Yan-hong,LI Yun-long, WANG Jue,YU Wen-hai,JING Shen-rong,HUANG Fen

(MedicalFaculty,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China)

To analyze the evolution trend and make a foundation for researching the infectious clone of swine Hepatitis E Virus (HEV), complete genome sequences of swine HEV was amplified by Reverse transcription nested PCR (RT-PCR). The homology and phylogenetic tree were analyzed by DNAStar and MEGA4.0 software, respectively. Results indicated that the full-length genome of swine HEV was successfully amplified by RT-nPCR and RACE. The homology analysis indicated that the swine HEV shared the highest homologies (96.1%) with swine HEV isolated from Xinjiang (GU119961). The phylogenetic tree suggested that this isolate belonged to swine HEV 4h sub-genotype.

swine hepatitis E virus; RT-nPCR; complete genome sequences analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.31360619)；云南省自然科學(xué)基金(No.2013FB032，2011FZ068)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(No.2014M562672)資助，楊臣臣和龍飛燕同等貢獻(xiàn)。

黃芬，Email:huangfen6789@163.com

昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 31360619), the Natural Science Foundation of Yunnan Province in China (Nos. 2011FZ068 and 2013FB032), and the China Postdoctoral Science Foundation(No. 2014M562672)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.011

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0547-05

2015-01-29；

2015-03-30