于晶峰，李 濱，劉曉松，常建華,楊曉野，王 瑞，楊蓮茹，李秀霞，木 蘭

細(xì)粒棘球蚴線粒體CO1基因的克隆與序列分析

于晶峰1,3，李 濱1，劉曉松2，常建華2,楊曉野1，王 瑞1，楊蓮茹1，李秀霞3，木 蘭3

目的 研究細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)種間遺傳標(biāo)記特點(diǎn),為該蟲種的分子分類學(xué)研究提供基礎(chǔ)。方法 在內(nèi)蒙古地區(qū)從羊肝臟采集細(xì)粒棘球蚴，肝包蟲病患者手術(shù)剝離囊包后，簽署知情同意書，采集細(xì)粒棘球蚴。提取蟲體DNA，擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素氧化酶1(CO1)基因，將其克隆到PGM-T載體后，用PCR技術(shù)鑒定陽性菌落，并進(jìn)行測序，運(yùn)用DNAstar5.0 軟件計(jì)算序列間的相似性，計(jì)算遺傳距離，同時(shí)，應(yīng)用MEGA4.0軟件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和鄰接法(NJ-Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 細(xì)粒棘球蚴DNA擴(kuò)增出的羊株、人株CO1基因序列片段長度為936 bp。同其他親緣關(guān)系較近的屬CO1基因序列比對：羊株、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與黃花棘球絳蟲的同源性最高，分別為91.9%、91.2%；羊株、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與黃花棘球絳蟲位于同一分支，自展值(Boostrap)最高，均為100%。羊株、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列所屬分支與原頭目的Proteocephalus macrocephalus所屬分支相隔較遠(yuǎn)。結(jié)論 CO1基因序列穩(wěn)定保守，無宿主特異性，可作為細(xì)粒棘球蚴理想的種間遺傳標(biāo)記。

細(xì)粒棘球蚴；CO1基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)屬帶科、棘球?qū)?，又稱包生絳蟲。成蟲寄生于犬科食肉動(dòng)物，幼蟲(棘球蚴)寄生于人和多種食草類家畜及其它動(dòng)物，引起一種嚴(yán)重的人獸共患病，稱棘球蚴病或包蟲病。棘球蚴病分布地域廣泛，隨著世界畜牧業(yè)的發(fā)展而不斷擴(kuò)散，已成為全球性重要的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)問題[1-2]。細(xì)粒棘球絳蟲的蟲株鑒定非常復(fù)雜，以往主要利用其形態(tài)學(xué)特征結(jié)合其他方面的資料(如流行病學(xué)、生物化學(xué)、同工酶分析)作為蟲株鑒定的根據(jù)[3]。雖然利用形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征能為蟲株的鑒定提供一些有價(jià)值的資料，但由于受到多種因素(如宿主和環(huán)境)的影響，并不能完全反映其基因水平的差異。而DNA序列作為遺傳信息的載體，在世代傳遞過程中，除保有遺傳穩(wěn)定外，還不斷的發(fā)生變異。因而，DNA序列分析對物種間的進(jìn)化關(guān)系的確立、種間和種內(nèi)親緣關(guān)系的確立均具有重要意義[4-5]。近年來，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，將動(dòng)物寄生蟲基因組DNA中的未知序列與已知序列(如GenBank、Ensembl、UCSC)進(jìn)行比較，進(jìn)而確定蟲種的種屬和分類。已成為分子生物學(xué)分析動(dòng)物寄生蟲進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)強(qiáng)有力的工具[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品細(xì)粒棘球蚴包囊采自內(nèi)蒙古錫盟西烏旗綿羊屠宰場，和錫林浩特市醫(yī)院包蟲病患者。錫盟西烏旗綿羊屠宰場調(diào)查成年綿羊與幼年綿羊共2 313只，患羊數(shù)量為30只，18名錫林浩特市某醫(yī)院B超檢查疑似包蟲病患者，手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)確診為包蟲病，患者均簽署知情同意書。收集囊包后用10 mL注射器將囊液吸出，離心1 min 30 s，使囊液與原頭蚴分離，-20 ℃保存。

1.1.2 菌種、載體及主要試劑 大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞、血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(DP304)、瓊脂糖膠回收試劑盒(DP209-03)、pGM-T連接試劑盒( VT202-02)均購自天根(北京)生化科技有限公司；Premix Ex Taq(RR003A)、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、10×Loading Buffer均購自大連寶生物工程有限公司；核酸染料，購自北京市賽百盛基因技術(shù)有限公司；其它鹽酸，氫氧化鈉等常規(guī)生化試劑由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)研究室提供。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA的提取按照血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒進(jìn)行。根據(jù)楊俊克[8]報(bào)道的細(xì)粒棘球蚴CO1基因的引物序列，上游引物(CO1-F):5′-TTGTTAGGTGGTTTGTCTGA-3′和下游引物(CO1-R):5′-GGCCATCACAAATAAACAT-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以提取的細(xì)粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA為模板，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。體系為80 μL(各組分用量：Premix Taq 40 μL,CO1-F 4 μL,CO1-R 4 μL模板4 μL,dH2O補(bǔ)足至80 μL)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃完全延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 擴(kuò)增片段的克隆與測序 利用瓊脂糖膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物的目的片段進(jìn)行純化。根據(jù)pGM-T載體說明書將膠回收的PCR產(chǎn)物與PGM-T載體進(jìn)行連接，目的PCR片段,XμL,pGM-T vector 1 μL,10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL,ddH2O補(bǔ)足至10 μL。載體與目的片段的摩爾比控制在1∶3～1∶8。輕彈混勻短暫離心后16 ℃水浴過夜連接。待反應(yīng)結(jié)束后立即將PCR管置于冰上。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，置于2 mL LB液體培養(yǎng)基中(含有Amp)，150 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，取1 μL進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件同1.2的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的條帶的陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 序列分析 應(yīng)用NCBI中的nucleotide blast對測得序列細(xì)粒棘球蚴的CO1基因進(jìn)行同源搜索。綜合考慮序列覆蓋率(Query coverage)、最大序列相似度(Max ident)、隨機(jī)匹配可能性(E value)3個(gè)因素，選取圓葉目、裂頭目(Diphyllobothriide)、原頭目(Proteocephalidea)等其他科屬種的CO1基因的序列(表1)，運(yùn)用DNAstar5.0 軟件計(jì)算序列間的相似性，計(jì)算遺傳距離，同時(shí)，應(yīng)用MEGA4.0軟件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和鄰接法(NJ-Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析。系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行自舉檢驗(yàn)(bootstrap)，檢驗(yàn)次數(shù)為1 000。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明CO1基因在約936 bp處獲得了特異性條帶，與預(yù)期片段大小吻合，無非特異性的擴(kuò)增條帶。

表1 15種絳蟲線粒體CO1基因相關(guān)資料

M:DL-2000分子量標(biāo)記；1:西烏旗羊株樣本；2～7:錫林浩特人株樣本；8:陰性對照

M:DL 2000 DNA marker；1:Xuwuqi sheep samples；2～7:Xilinhaote human samples；8:Negative control

圖1 細(xì)粒棘球蚴CO1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of CO1 gene fromEchinococcusgranulosus

2.2 克隆結(jié)果 陽性菌液經(jīng)PCR鑒定和1%瓊脂凝膠電泳檢測后，在800 bp～1 000 bp之間出現(xiàn)了清晰的特異性條帶(見圖2)。

2.3 測序結(jié)果

M：DL-2000分子量標(biāo)記；1：西烏旗羊株樣本；2～7：錫林浩特樣人株本；8：陰性對照

M：DL 2000 DNA marker；1：Xuwuqi sheep samples；2～7： Xilinhaote human samples；8：Negative control

圖2 陽性克隆菌液PCR鑒定電泳結(jié)果

Fig.2 Electrophoresis results of positive clone bacterium by PCR amplification

2.3.1 西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列 西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴以CO1-F、CO1-R為引物，通過PCR糖擴(kuò)增獲得了CO1基因部分序列，經(jīng)克隆測序、去載體接頭等處理獲得了長度為936 bp的序列，其A、G、T、C的含量分別為15.60%、25.00%、48.72%、10.68%，A+T含量為64.32%。具體序列如下：

The shaded region was the prime poistion

2.3.2 錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列 錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴DNA樣品經(jīng)克隆測序所得的序列長度也為936 bp，其A、G、T、C的含量分別為15.60%、25.11%、47.54%、11.75%，A+T含量為63.14%。具體序列如下：

The shaded region was the prime poistion

2.3.3 序列比對結(jié)果 對比結(jié)果顯示西烏旗羊株與錫林浩特人株細(xì)粒棘球蚴的同源性為98.5%，變異率為1.5%，相應(yīng)區(qū)域存在12個(gè)變異位點(diǎn)，突變類型均為轉(zhuǎn)換，即G與A置換和T與C置換。將獲得的羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源分析，通過nucleotide blast同源比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)結(jié)果表明羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與蒙古細(xì)粒棘球蚴的CO1基因序列相似性最高，人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與伊朗細(xì)粒棘球蚴的CO1基因序列相似性最高，相似性均在99%以上，基因型均是G1型。羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列的相似性也達(dá)到了99%。

2.3.4 基因序列同源性與遺傳距離分析 羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列均與圓葉目、帶絳蟲科的黃花棘球絳蟲的同源性最高，分別為91.9%、91.2%；羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與圓葉目、帶絳蟲科的黃花棘球絳蟲的遺傳距離最小，分別為0.086、0.092。

采用ML法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列與帶絳蟲科的黃花棘球絳蟲位于同一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹的自舉檢驗(yàn)值(Boostrap)最高，均為100%(圖3、圖4)。羊株細(xì)粒棘球蚴CO1序列、人株細(xì)粒棘球蚴CO1序列所屬分支與原頭目的Proteocephalus macrocephalus所屬分支相隔較遠(yuǎn)。

3 討 論

圖3 基于CO1構(gòu)建的17種絳蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML-Maximum Likelihood法)

Fig.3 Phylogenetic treebased CO1 among 17 kinds of tapeworm(ML-Maximum Likelihood method)

圖4 基于CO1構(gòu)建的17種絳蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ-NeighborJoining法)

Fig.4 Phylogenetic treebased CO1 among 17 kinds of tapeworm(NJ method)

mtDNA是生物體細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的場所。線粒體因其進(jìn)化速率快，母系遺傳、基因重組率低、獨(dú)立進(jìn)化、基因組精簡等特點(diǎn)[3]。已成為重要的分子標(biāo)記，廣泛的用于物種基因遺傳變異的研究，尤其更適合于種下分類學(xué)的研究[8]。目前mtDNA基因組及其相關(guān)編碼基因序列已廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分類和系統(tǒng)發(fā)生等方面的研究。在細(xì)粒棘球蚴研究方面，馬秀敏等(2007)[9]對新疆不同地區(qū)44個(gè)患有細(xì)粒棘球蚴病的病人進(jìn)行了研究，根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲mtDNA rrnL的特征構(gòu)建了PCR-RFLP技術(shù)，即可用于其基因型的鑒定。近年來，國內(nèi)外專家陸續(xù)報(bào)道了有關(guān)細(xì)粒棘球絳蟲基因型的研究進(jìn)展，而基因型之間的對比也是當(dāng)今學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題[10-13]。楊俊克等(2004年)[8]用線粒體DNA的CO1基因測序的方法，調(diào)查了采自青海省、甘肅省和新疆維吾爾族自治區(qū)的24株細(xì)粒棘球蚴分離株基因型的變異情況，結(jié)果表明不同地區(qū)CO1基因變異率均在1%以下，這與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果相一致，即內(nèi)蒙古兩地區(qū)的細(xì)粒棘球蚴線粒體CO1基因序列高度相似，不因宿主的不同而出現(xiàn)明顯的差異，這為將來全面了解內(nèi)蒙古地區(qū)基因變異情況提供了理論依據(jù)。

進(jìn)化樹的構(gòu)建有助于我們了解物種的進(jìn)化歷史，為生物學(xué)中物種的分類提供可靠的依據(jù)。通過比較不同絳蟲CO1基因序列顯示，雖然此基因在不同種屬絳蟲間有部分序列相當(dāng)保守，但各種屬絳蟲間仍存在著特定的差異。這些差異與種系發(fā)生的遠(yuǎn)近程度存在一定的關(guān)系。如細(xì)粒棘球蚴與同屬帶絳蟲科的黃花棘球絳蟲的同源性達(dá)到了91.9%；而與演化關(guān)系較為疏遠(yuǎn)的Diplogonoporus balaenopterae則差異較大(同源性僅為75.2%)，分屬不同的種屬(Diplogonoporus balaenopterae，裂頭目，裂頭科)。CO1基因的進(jìn)化分析都將細(xì)粒棘球蚴與黃花棘球絳蟲劃到了同一個(gè)分支，這說明他們之間發(fā)生分歧的時(shí)間較短，可能在生活習(xí)性方面還存在某些相似性。

[1]Dakkak A. Echinococcosis / hydatidosis: a severe threat in Mediterranean countries[J]. Vet parasitological, 2010, 174 (1/2):2-11.

[2]Romig T, Dinkel A, Mackenstedt U. The present situation of echinococcosis in Europe[J]. Parasitol Int, 2006, 55(Suppl): S187-191.

[3]Li Bin.Epidemiological Investigation ofEchinococcusgranulosusand Analysis of CO1 and ND1 Gene Sequence[D].Department of Preventive Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University,2013:14.(in Chinese) 李濱.細(xì)粒棘球蚴的流行病調(diào)查及CO1與ND1基因序列分析[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué),2013:14.

[4]Folmer O, Biack M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification and mitochondrial cytoehrome coxidase subunit 1 from diverse metazoan invertebrate[J]. Mo1 MarBio1 Biotechnol, 1994, 3:29.

[5]Tie YM, Ma JX, Wang YD. Investigation on cystic echinococcosis for sheep from Xinghai region[J]. Qinghai Agr Anim Husb, 2008, 38(7): 612-615. (in Chinese) 鐵永梅,馬建霞,王永殿.興海地區(qū)綿羊棘球蚴病調(diào)查[J].青海農(nóng)牧業(yè),2008, 38(7): 612-615. (in Chinese)

[6]Xu ZJ, Zhang CY, Tan YH, et al. Prevalence of hydatid disease in Heilongjiang Province[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2004, 22(2): 93. (in Chinese) 徐之杰,張崇友,鐔云輝,等.黑龍江省棘球蚴病流行概況[J].中國寄生蟲學(xué)和寄生蟲病,2004,22(2):93.

[7]Ishida N, Hasegawa T, Takeda K, et al. Polymorphic sequence in the D-loop region of equine mitochondrial DNA[J]. Animal Genetics, 1994, 25: 215-221.(in Chinese)

[8]Yang JK, Jia WZ, Jing tao,et al.Three provinces E.granulosus Gene Variation Analysis in china[J].Chinese Journal of Veterinary Science and Technology,2004,34(9)：12-16.(in Chinese) 楊俊克,賈萬忠,景濤,等.我國三省區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲基因的變異分析[J].中國獸醫(yī)科技,2004,34(9):12-16.

[9]Ma XM.WULAMU MT,Ding JB,et al.PCR-RFLP technique in E.granulosus seed strains Identification[J].Journal of Pathogen Biology,2008,3(4):281-287.(in Chinese) 馬秀敏,吾拉木馬木提,丁劍冰,等.PCR-RFLP技術(shù)在細(xì)粒棘球絳蟲種株鑒定中的應(yīng)用[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(4):281-287.

[10]Feagin JE. Mitoehondrial genome diversity in parasites[J].Int J Parasitol, 2000, 30: 371-390.

[11]Tu BX, Zhang WL, Zhang WB, et al. Investigation onEchinococcusgranulosusinfection in camel from Alashan of Inner Mongolia[J]. Endem Dis Bull, 2003, 18(2): 99 (in Chinese) 圖布新,張文林,張文彬,等.內(nèi)蒙古阿拉善左旗駱駝中細(xì)粒棘球蚴感染的調(diào)查[J].地方病通報(bào),2003,18(2):99.

[12]Liu GH, Dai RS, Zhao GH, et al. Cloning and sequence analysis of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 fromTaeniahydatigenaisolates from Changsha and Xiangxi in Hunan province[J]. J Trop Med, 2009, 9(2): 117-120. (in Chinese) 劉國華,戴榮四,趙光輝,等.湖南長沙及湘西泡狀帶絳蟲分離株線粒體cox1基因的克隆及序列分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2009,9(2):117-120.

[13]Brown G G, Gadaleta G, Pepe G, et al. Structural conservation and variation in the D-loop containing region of vertebrate mitochondrial DNA[J]. J Mol Biol, 1986, 192: 503-511.

Yang Xiao-ye,Email：xiaoyeyang122@sohu.com;Mu lan,Email: wodetenghe@126.com

Cloning and sequence analysis of the partial CO1 gene within mitochondrial DNA ofEchinococcusgranulosus

YU Jing-feng1,3,LI Bin1,LIU Xiao-song2,CHANG Jian-hua2, YANG Xiao-ye1,WANG Rui1,YANG Lian-ru1,LI Xiu-xia3,MU Lan3

(1.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDisease，MinistryofAgriculture；CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China; 2.InnerMongoliaAcademyofAgricultural&AnimalHusbandrySciences，Hohhot010031,China; 3.SchoolofBasicMedicalScience，InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China)

We investigated the inter-specific genetic marker ofEchinococcusgranulosus, which was used for further study in molecular classification. The genomic DNA ofEchinococcusgranulosuscollected from the infected sheep and people in Inner Mongolia were extracted. The mitochondrial cytochrome oxidase subunit 1 ( CO1) gene was amplified by PCR using universal primers, and then the PCR product was cloned into pGM-T vectors. The insert was sequenced successfully and compared with other cestodes sequences by DNAStar 5.0 and MEGA 4.0. Results showed that the PCR product was 936 bp in length. Compared with other CO1 gene sequences of related cestodes, the homology amongEchinococcusgranulosusandEchinococcuscanadensiswere 91.9% and 91.2%.EchinococcusgranulosusandEchinococcuscanadensiswere in the same branch, and bootstrap values (Boostrap) in the highest was 100%.Echinococcusgranulosusaffiliated branch of the original leaders of the branch belonged toProteocephalusmacrocephalusfar apart. It suggested that the CO1 gene sequences were stably conservative and non-host-specific, which can be used as an ideal species amongEchinococcusgranulosusgenetic markers.

Echinococcusgranulosus; CO1 gene; cloning; sequence analysis

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)資助(No.201103008，No.201303037)

楊曉野,Email：xiaoyeyang122@sohu.com； 木 蘭, Email:wodetenghe@126.com

1.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，呼和浩特 010031; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110

Supported by the National Public Service Sectors (Agriculture) Special Funding(Nos.201103008 and No.201303037 )

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.008

R383.3

A

1002-2694(2015)06-0532-05

2015-03-02；

2015-05-20