張 競(jìng)，徐曉月，何 燕

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003）

西曲瑞克為新合成的促性腺激素釋放激素拮抗劑，多用于接受控制性超排卵輔助生殖治療的婦女，防止過早出現(xiàn)的促黃體生成激素（LH）峰及控制隨后的排卵，以及治療子宮內(nèi)膜異位癥[1]。筆者根據(jù)藥物分類和藥品注冊(cè)管理辦法及注射劑研制要求，按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2005年《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》對(duì)注射用醋酸西曲瑞克的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器與試藥

CP225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；UW8200S型電子天平（日本Shimadzu公司）；SF2000型三按鍵電子數(shù)顯卡尺（桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司）；RTZ－10A－RT型嬰兒秤（無(wú)錫市衡器廠）；GD100型恒溫循環(huán)水浴鍋（英國(guó) Grant公司）；CH30型顯微鏡（日本Olympus公司）。注射用醋酸西曲瑞克（受試藥物，開封明仁藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每瓶 0.25 mg，批號(hào)為 20120501）；注射用醋酸西曲瑞克（參比藥物，德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司，規(guī)格為每瓶 0.25 mg，批號(hào)為 1D326A）；氯化鈉注射液（上海百正許昌藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每支 100 mL∶0.9 g，批號(hào)為1112001）；牛血清白蛋白（瑞士Roche公司，規(guī)格為每瓶5 g，批號(hào)為A8020）；伊文思藍(lán)（上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝，批號(hào)為 08－11－02）。

1.2 動(dòng)物

豚鼠，體重 250～350 g，雌性（無(wú)孕），質(zhì)量合格證號(hào)為41001900000173；日本大耳白家兔，體重 2.0 ～3.0 kg，雌性（無(wú)孕），質(zhì)量合格證號(hào)為41001900000213；均購(gòu)自河南省康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物試驗(yàn)許可證號(hào) SCXK＜豫＞2011－0001）。動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)飼料購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)為 SCXK＜豫＞2010－0002）。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，環(huán)境通風(fēng)良好，12 h光照明暗交替，溫度（23±2）℃，濕度50% ～65%。

1.3 劑量換算[2]

注射用醋酸西曲瑞克用于下腹壁皮下注射，每日1次，每次0.25 mg，用注射用水溶解。以 60 kg體重計(jì)，臨床最大成人用劑量為 0.004 2 mg/kg，最大給藥濃度為 0.25 g /L；豚鼠以 300 g體重計(jì)、家兔以 2.5 kg體重計(jì)，豚鼠和家兔等效劑量分別為0.022 1 mg/kg 和 0.010 2 mg /kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 全身主動(dòng)過敏性試驗(yàn)[2－5]

方法：取健康豚鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為0.9%氯化鈉注射液陰性組；0.5%牛血清白蛋白陽(yáng)性組；注射用醋酸西曲瑞克高劑量組，給藥濃度 0.05 g /L，致敏劑量 0.083 mg /kg，激發(fā)劑量0.167 mg/kg；注射用醋酸西曲瑞克低劑量組，給藥濃度0.025 g /L，致敏劑量 0.042 mg /kg，激發(fā)劑量 0.083 mg /kg。隔日每只腹腔注射供試液0.5 mL，共3次。然后將各組再均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14及21日，由耳緣靜脈注射供試液1.0 mL進(jìn)行激發(fā)。每日觀察動(dòng)物癥狀，首次、末次致敏和激發(fā)前稱量動(dòng)物體重。靜脈注射后30 min內(nèi)，按表1詳細(xì)觀察每只動(dòng)物的癥狀反應(yīng)、癥狀出現(xiàn)及消失的時(shí)間。最長(zhǎng)觀察3 h，并按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度，計(jì)算過敏反應(yīng)發(fā)生率，根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生程度和發(fā)生率進(jìn)行綜合判斷。

結(jié)果：陰性組和注射用醋酸西曲瑞克高、低劑量組豚鼠均未出現(xiàn)過敏癥狀，而陽(yáng)性組6只豚鼠在激發(fā)后均出現(xiàn)過敏反應(yīng)，2只為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋），癥狀評(píng)分為14分和15分；4只為極強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋＋），癥狀評(píng)分為20分。

表1 全身主動(dòng)過敏反應(yīng)癥狀和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2 被動(dòng)皮膚過敏性試驗(yàn)

抗體制備：取健康豚鼠8只，隨機(jī)分成4組，每組2只，分組及給藥方法同2.1項(xiàng)。隔日每只腹腔注射供試液0.5 mL，共3次。首次注射后第 14日自心臟采血 5 mL，2 000 r/min，離心 10 min后分離血清，每組2只豚鼠血清合并，分別制得混合抗血清，保存于－20℃環(huán)境，備用。

試驗(yàn)方法：取健康豚鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組 6只，分別為陰性組、陽(yáng)性組、高劑量組、低劑量組。動(dòng)物背部脫毛面積3 cm×4 cm，然后皮內(nèi)注射各對(duì)應(yīng)組的混合抗血清0.1 mL（稀釋度為1∶4），進(jìn)行被動(dòng)致敏。24 h后各組分別耳緣靜脈注射含1%伊文思藍(lán)染料的對(duì)應(yīng)供試液1.0 mL，進(jìn)行激發(fā)。30 min后將動(dòng)物脫臼處死，剪取背部致敏部位皮膚，測(cè)量?jī)?nèi)層藍(lán)色反應(yīng)斑的直徑大小，不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長(zhǎng)徑與短徑之和的一半,直徑大于5 mm者判定為陽(yáng)性。

結(jié)果：陰性組和注射用醋酸西曲瑞克高、低劑量組豚鼠均未出現(xiàn)藍(lán)斑，為陰性；而陽(yáng)性組豚鼠皮膚內(nèi)層藍(lán)斑直徑均大于5 mm，分別為 14.58，15.86，15.53，18.29，14.54，17.04 mm，平均15.97 mm，為陽(yáng)性。

2.3 溶血性試驗(yàn)[5－8]

紅細(xì)胞懸液配制：取健康家兔1只，心臟取血10 mL，放入含玻璃珠的干燥三角瓶中振搖10 min，使成脫纖血液，移入刻度離心管內(nèi)，加入約 10倍量 0.9%氯化鈉注射液，搖勻，1 500 r/min離心15 min后傾去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再加0.9%氯化鈉注射液同法反復(fù)洗滌2～3次，至上清液無(wú)色透明為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液按其容積稀釋成2%的混懸液，備用。

試驗(yàn)方法：取潔凈玻璃試管14支進(jìn)行編號(hào)，1～5號(hào)管為受試藥物管，7～11號(hào)管為參比藥物管，6號(hào)管和12號(hào)管為供試品對(duì)照管，13號(hào)管為陰性對(duì)照管，14號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。按表2所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉注射液、純化水、受試藥物（0.062 5 g/L，0.25 g/L 經(jīng) 1 ∶3 稀釋）、參比藥物（0.062 5 g /L，0.25 g/L 經(jīng) 1 ∶3 稀釋），混勻，立即置（37±0.5）℃ 的恒溫水浴鍋中進(jìn)行溫育，觀察是否有溶血和凝聚發(fā)生，開始每隔15 min觀察1次，1 h后每隔1 h觀察 1次，最長(zhǎng)觀察3 h。

結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照管加入純化水后，溶液立即呈澄明紅色，管底幾無(wú)紅細(xì)胞殘留，表明全溶血；陰性對(duì)照管上清液澄明無(wú)色，紅細(xì)胞全部下沉，經(jīng)振搖后可均勻分散，顯微鏡下觀察，紅細(xì)胞形態(tài)正常；3 h時(shí)肉眼觀察，受試藥物和參比藥物注射用醋酸西曲瑞克各管紅細(xì)胞沉積于試管底部，上層液無(wú)色澄明，1號(hào)試管壁上有少量紅細(xì)胞黏附，經(jīng)振搖后紅細(xì)胞可分散；顯微鏡下觀察，1，2，3，7，8，9號(hào)管均有紅細(xì)胞聚集現(xiàn)象，1至3號(hào)管程度逐漸減輕，總體程度較輕，每個(gè)視野內(nèi)有1～2個(gè)兩兩聚集的紅細(xì)胞團(tuán)，滴加氯化鈉注射液后聚集未散，4，5，10，11號(hào)管紅細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)聚集現(xiàn)象。結(jié)果見表3。

表2 加樣順序

表3 受試藥物溶血性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 皮下刺激性試驗(yàn)[2，7]

方法：取健康家兔4只，試驗(yàn)前24 h動(dòng)物背部?jī)蓚?cè)脫毛，去毛范圍每側(cè)各約7 cm×7 cm。采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，左側(cè)背部皮下注射滅菌注射用水，右側(cè)背部皮下注射注射用醋酸西曲瑞克 0.1 mg/kg，給藥濃度為 0.25 g /L，給藥容積均為每只1.0 mL。觀察給藥后不同時(shí)間注射局部反應(yīng)情況，注射后48 h處死動(dòng)物，解剖取出皮下組織，觀察注射部位組織的變化，并進(jìn)行局部病理組織學(xué)檢查。兔皮膚橫切面取材，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水包埋，切片4 μm，HE染色。根據(jù)肉眼觀察和病理組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

結(jié)果：在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察，家兔皮膚正常，注射部位正常，未見充血、紅腫、變性、壞死等現(xiàn)象。病理檢查結(jié)果顯示，受試藥物組兔皮膚結(jié)構(gòu)正常，皮膚內(nèi)有汗腺、皮脂腺和毛發(fā)等，周圍組織無(wú)壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與空白對(duì)照組比較，無(wú)明顯病理變化。結(jié)果見圖 1。

圖1 皮下組織刺激性試驗(yàn)病理照片（×100）

3 討論

注射藥物安全性評(píng)價(jià)是藥物臨床前試驗(yàn)研究的重要組成部分，若有任何一項(xiàng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則表明該藥物不符合安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不能供臨床注射使用。注射用醋酸西曲瑞克目前已在中國(guó)上市，鮮有發(fā)生過敏反應(yīng)的報(bào)道。在此次體外溶血性試驗(yàn)中，受試藥物和參比藥物高濃度均出現(xiàn)輕微的紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，而低濃度未出現(xiàn)凝聚，凝聚程度和藥物濃度呈正相關(guān)。鑒于溶血和凝聚反應(yīng)發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，藥物的活性成分及其代謝產(chǎn)物、有關(guān)物質(zhì)、輔料、生產(chǎn)工藝及理化性質(zhì)（如滲透壓、pH等）均有可能引起溶血或凝聚反應(yīng)的發(fā)生，而且凝聚現(xiàn)象的判斷受主觀因素影響比較大，易出現(xiàn)漏洞。因此，在以后的研究中應(yīng)采用合理的方法和手段，提高溶血性研究的靈敏性和準(zhǔn)確性，以避免假陰性或假陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)[8－10]。由于目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的臨床前體內(nèi)試驗(yàn)方法全面評(píng)價(jià)藥物制劑的溶血反應(yīng)，因此在長(zhǎng)期毒性研究中應(yīng)該兼顧制劑的溶血性，注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)和體征，以綜合評(píng)價(jià)藥物的溶血性，并加強(qiáng)臨床應(yīng)用不良反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步考察注射用醋酸西曲瑞克的安全性，保證臨床用藥安全。

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