陳琛，卞晶晶，劉曉萍，張靜，于忠杰，楊童茜

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266021）

越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。4－（甲基亞硝氨基）－3－吡啶－1－丁酮（NNK）是7種煙草煙霧中最強(qiáng)的致癌劑，經(jīng)口腔、注射、氣管支氣管灌注等途徑給予NNK，可成功建立肺癌模型［1］。脂多糖（LPS）是革蘭陰性桿菌外膜的重要組成部分，是研究中廣泛應(yīng)用的致炎因子。近年來(lái)，有學(xué)者通過(guò)給予NNK和LPS聯(lián)合刺激來(lái)制備肺癌動(dòng)物模型。既往研究結(jié)果顯示，LPS單獨(dú)應(yīng)用并不能誘發(fā)小鼠肺癌發(fā)生，當(dāng)與NNK聯(lián)合刺激時(shí)，NNK的致瘤效果明顯增強(qiáng)［1］，但其機(jī)制尚不清楚。肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，其在LPS和NNK聯(lián)合刺激誘發(fā)肺癌過(guò)程中的變化報(bào)道甚少。活化的巨噬細(xì)胞至少包括M1、M2兩種類(lèi)型：M1型巨噬細(xì)胞可分泌腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白細(xì)胞介素（IL）－1α以及IL－6等，并可使誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)升高；M2型巨噬細(xì)胞是一種抑制型細(xì)胞，可分泌IL－10、IL－4等抗炎因子，精氨酸酶（Arginase）高表達(dá)為其特征［2－3］。C－myc和核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，其基因編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)［4］。C－myc基因在肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、乳癌和胃癌等多種腫瘤組織過(guò)度表達(dá)［5］。本實(shí)驗(yàn)在體外研究LPS、NNK以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探討炎癥促發(fā)癌癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Raw264.7細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，NNK購(gòu)自美國(guó)Toronto Research Chemicals公司，RNA抽提試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT－PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Applied biosystems公司，TNF－α與IL－6酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Nexcelom Bioscience，Lawrence，MA）購(gòu)自美國(guó) Nexcelom Bioscience公司，7900HT快速實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Applied biosystems公司。

1.2 引物合成

根據(jù)NCBI中的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由美國(guó)Operon公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及LPS、NNK濃度選擇 將RAW264.7細(xì)胞置于含有體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，并添加105U／L青霉素和鏈霉素，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴(kuò)增。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)5h貼壁后，隨機(jī)分為對(duì)照組、NNK組和LPS組。LPS組和NNK組分別加入10μg／L、250μg／L、1mg／L、4mg／L的LPS和5、10、25、100μmol／L的NNK，對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，然后孵育Raw264.7細(xì)胞24h，每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。應(yīng)用氯仿－異戊醇法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，結(jié)果以2△△Ct表示。

表1 PCR所用引物名稱(chēng)及其序列

1.3.2 巨噬細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞，以32×106／L接種于12孔板，培養(yǎng)5h后，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、NNK組（B組）、LPS組（C組）和LPS＋NNK組（D組），每組設(shè)3個(gè)平行孔。所用NNK濃度為10μmol／L，LPS濃度為1mg／L，對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)單位體積內(nèi)細(xì)胞，判定細(xì)胞增殖狀態(tài)。

1.3.3 巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞，培養(yǎng)5h貼壁后隨機(jī)分組，分組及用藥方法同1.3.2。孵育24h抽提RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)，檢測(cè) C－myc、NF－κB、Arginase、iNOS、IL－6和IL－1αmRNA 表達(dá)。每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.4 巨噬細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)檢測(cè) 取8×104個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)5h，分組及用藥同1.3.2。于培養(yǎng)24h收集細(xì)胞，提取樣品蛋白，使用TNF－α與IL－6酶聯(lián)免疫試劑盒定量檢測(cè)IL－6和TNF－α蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以表示，應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析觀察組間是否存在交互作用，析因結(jié)果存在交互作用時(shí)使用One way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)一步分析各因素的單獨(dú)效應(yīng)。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 LPS和NNK實(shí)驗(yàn)濃度選擇

以濃度為10μg／L、250μg／L、1mg／L、4mg／L的LPS孵育Raw264.7細(xì)胞24h，細(xì)胞C－myc mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為22.89±1.71、41.73±2.22、61.35±11.24、41.80±5.71；對(duì)照組細(xì)胞C－myc mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.16。LPS可上調(diào) Raw264.7細(xì)胞C－myc mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中濃度為1mg／L的LPS作用最顯著（F＝605.6，P＜0.01）。5、10、25、100μmol／L的NNK孵育Raw264.7細(xì)胞24h，細(xì)胞C－myc mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.71±0.23、0.99±0.17、0.83±0.14、0.70±0.16，呈 下 降 趨勢(shì)，但與對(duì)照組（1.00±0.16）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故選擇1mg／L的LPS和10μmol／L的NNK用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較

C組Raw264.7細(xì)胞的增殖與A組相比差異有顯著性（F＝5.28，q＝3.18，P＜0.05），而B(niǎo)組與 A組比較、D組與C組相比較差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)比較

B組Raw264.7細(xì)胞各基因表達(dá)與A組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C、D組Raw264.7細(xì)胞各基因表達(dá)均較 A組顯著升高（F＝19.4～5 895.0，t＝4.04～97.53，P＜0.05）。D組 C－myc mRNA 的表達(dá)顯著低于C組（t＝4.80，P＜0.01），而 NF－κB和IL－1αmRNA的表達(dá)則均顯著高于C組（t＝3.76、2.81，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)比較

B組細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)與A組比較差異無(wú)顯著意義。C、D組細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)較 A組顯著升高（F＝1 213.0、110.2，t＝29.40～44.76，P＜0.01）；D 組 TNF－α蛋白表達(dá)顯著低于 C組（t＝3.74，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠巨噬細(xì)胞增殖及相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較（n＝6，）

表2 各組小鼠巨噬細(xì)胞增殖及相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較（n＝6，）

組別 細(xì)胞增殖（ccell／105·L－1） C－myc NF－κB iNOS Arginase IL－6 IL－1α A 組 7.00±0.63 1.00± 0.31 1.00±0.17 1.00± 0.16 1.00± 0.32 1.00± 0.24 1.00±0.26 B 組 7.17±0.89 1.00± 0.17 0.94±0.08 1.21± 0.38 1.06± 0.43 3.09± 0.50 0.97±0.36 C 組 5.02±0.26 61.35±11.24 4.85±1.40 539.50±113.00 28.45±10.70 67 143.00±16 146.00 3.19±0.25 D 組 5.85±1.04 37.79± 8.54 6.30±1.68 624.60±185.90 19.66±10.97 92 576.00±13 288.00 2.45±0.32

表3 各組細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)比較（n＝6，ρ／μg·L－1，）

表3 各組細(xì)胞IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)比較（n＝6，ρ／μg·L－1，）

組別 IL－6 TNF－a A 組 1.512±0.239 3.368±0.142 B 組 1.613±0.364 3.392±0.500 C 組 38.510±2.290 42.770±6.211 D 組 34.920±3.430 33.110±4.670

3 討 論

在癌癥發(fā)展過(guò)程中炎癥有兩個(gè)方面的作用。一方面是殺滅腫瘤，在這種情況下，炎癥誘導(dǎo)各種免疫細(xì)胞到達(dá)腫瘤位點(diǎn)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞凋亡。如果腫瘤細(xì)胞在此階段被完全消除，炎癥減弱且組織重塑，僅引發(fā)特定區(qū)域的急性炎癥。另一方面可以刺激癌變，炎癥可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，造成基因突變。已有研究結(jié)果表明，炎癥可以增加至少3個(gè)靶基因（Cmyc、Aurka和Pim1）的基因組不穩(wěn)定和突變；腫瘤細(xì)胞可以在炎癥環(huán)境下生存，慢性炎癥通?？梢蕴峁┯欣谀[瘤發(fā)展的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)或惡變［6］。

C－myc基因是myc基因家族的成員之一，屬核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其編碼蛋白介導(dǎo)細(xì)胞外傳入細(xì)胞內(nèi)的生物信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)控［7－8］。C－myc在細(xì)胞靜止期不表達(dá)，而在有絲分裂原作用下迅速表達(dá)，促使細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)，最終細(xì)胞增殖異常而癌變［9－10］。已有研究證實(shí)，C－myc基因在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中高表達(dá)，在癌旁組織中的表達(dá)明顯下降，而在正常肝組織中則不表達(dá)，提示C－myc基因過(guò)度表達(dá)可能是誘發(fā)HCC的原因之一［11］。有研究表明，C－myc控制著45%的表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因，參與巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，調(diào)控促癌基因的表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)改變［8］。本文結(jié)果顯示，濃度為5～100μmol／L的 NNK 對(duì) Raw264.7細(xì)胞 C－myc mRNA表達(dá)和增殖無(wú)顯著影響；LPS在10μg／L～4mg／L的濃度范圍則可以顯著上調(diào)Raw264.7細(xì)胞C－myc mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以濃度為1mg／L的LPS作用最強(qiáng)。當(dāng)LPS與NNK聯(lián)合刺激時(shí)，小鼠Raw264.7細(xì)胞C－myc mRNA也呈高表達(dá)，但較單獨(dú)LPS刺激的作用弱。同時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，胞核變大，細(xì)胞變大并伸出偽足狀突起，呈現(xiàn)出活化狀態(tài)。提示LPS與NNK聯(lián)合刺激可能進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的活化。

我們前期研究結(jié)果顯示，應(yīng)用不同濃度的炎性啟動(dòng)因子LPS體外孵育可以明顯促進(jìn)人肺腺癌上皮A549細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步提示LPS有激活肺癌細(xì)胞增殖的作用［12］。為進(jìn)一步驗(yàn)證LPS和NNK聯(lián)合孵育對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，本實(shí)驗(yàn)分析了LPS和NNK對(duì)巨噬細(xì)胞 NF－κB、Arginase、iNOS、IL－1α、IL－6mRNA 和TNF－α、IL－6蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，單獨(dú)NNK孵育對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，而LPS孵育可顯著刺激巨噬細(xì)胞高表達(dá)C－myc等相關(guān)基因和蛋白，提示LPS主要激活M1型巨噬細(xì)胞。當(dāng)LPS＋NNK聯(lián)合孵育Raw264.7細(xì)胞時(shí)，NNK 強(qiáng)化了 LPS激活 NF－κB、IL－1α基因的作用；促進(jìn)了M1型巨噬細(xì)胞的激活，進(jìn)而刺激M1型細(xì)胞產(chǎn)生和分泌IL－1α。這些炎性遞質(zhì)進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)iNOS等，從而導(dǎo)致NO合成大大增加，導(dǎo)致正常細(xì)胞DNA的損傷，阻礙DNA修復(fù)，誘導(dǎo)基因突變，刺激肺癌形成。如果改變LPS或NNK的反應(yīng)時(shí)間，是否還會(huì)發(fā)生同樣的變化尚需進(jìn)一步研究。

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