邰宏博 唐麗薇 陳帶娣 伊日布斯

摘要：褐藻膠寡糖（alginateoligosaccharides，AOS）是褐藻膠降解而形成的一種功能性寡糖，具有廣泛的生物活性，如促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆性、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等。褐藻膠寡糖的制備方法主要分為：化學(xué)法、物理法和酶解法。不同的方法制備出的褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)亦有所不同。介紹了化學(xué)法、物理法和酶解法等各種褐藻膠寡糖制備方法的研究現(xiàn)狀、存在的問題及發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞：褐藻膠；褐藻肢寡糖；寡糖的制備

中圖分類號：Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0075-05

ProgressesonPreparationofAlginateOligosaccharide

TAIHong-ho，TANGLi-wei，CHENDai—di，CHAGANIrbis*

（LaboratoryofBioconvertion，F(xiàn)acultyofLifeScienceandTechnology，KunmingUiversityofScienceandTechnology，Kunming 650500，Yunnan，China）

Abstract：Alginateoligosaccharides（AOS），formedbyalginatedegradation，isafunctionaloligosaccharides.AOShasalotofbiologicalactivities，suchasplantgrowthpromotion，plantabioticstressresistance，antitumor，hacteriostasisandsoon.Themethodsofalginateoligosaccharidespreparationinclude：chemicaldegradation，physicaldegradationandenzymedegradation.Thestateofthefieldofpreparationofalginateoligosaccharidesbychemicaldegradation，physicaldegradationandenzymedegradation，andtheproblemsanddevelopmenttrendsareintroduced.

Keywords：alginate；alginateoligosaccharides（AOS）；preparationofoligosaccharide

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：075?079）

寡糖（Oligosaccharide）又稱低聚糖，是2?20個單糖單位以糖苷鍵相連形成的糖分子。寡糖經(jīng)水解后，每分子產(chǎn)生為數(shù)較少的單糖，寡糖與多糖之間并沒有嚴(yán)格的界限。寡糖是生物體內(nèi)一種重要的信息物質(zhì)，在生命過程中具有重要的功能，如細(xì)胞信號識別作用[1]。

褐藻膠是一種陰離子酸性多糖，由α-L-古羅糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）通過1-4糖苷鍵無序連接的線性多糖（圖1），主要存在于馬尾藻、巨藻、海帶等褐藻中，一些細(xì)菌也能分泌褐藻膠[2]。來源于海藻和細(xì)菌的褐藻膠結(jié)構(gòu)差異僅在于細(xì)菌褐藻膠中C2和/或C3羥基會被不同程度乙?；痆3]。褐藻膠寡糖是褐藻膠的寡聚物，其相對分子質(zhì)量低，具有水溶性好、穩(wěn)定性高、安全無毒的理化特性，有很多報道稱低相對分子質(zhì)量的褐藻膠寡糖具有多種生物活性，如促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆性、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等，在農(nóng)業(yè)、功能食品開發(fā)、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的幵發(fā)前景。傳統(tǒng)制備褐藻膠寡糖的方法主要是化學(xué)降解法和酶解法。隨著科技的發(fā)展，在化學(xué)降解法的基礎(chǔ)上，衍生出過氧化氫法。此外，物理法作為一種簡單快速的制備方法受到了人們的關(guān)注不同方法制備的褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)有所不同：酶解法得到的是不飽和糖醛酸寡糖，即在非還原端C4，5之間形成不飽和雙鍵[4]；而化學(xué)降解法得到的是飽和糖醛酸寡糖褐藻膠的相對分子質(zhì)量和G/M比率決定了它的理化和生物特性[5]，因此獲得不同結(jié)構(gòu)的褐藻膠寡糖將對其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義本文主要闡述了近年來褐藻膠寡糖的制備研究進(jìn)展.

1褐藻膠寡糖的制備

1.1化學(xué)降解法

化學(xué)降解法是生產(chǎn)褐藻膠寡糖的傳統(tǒng)方法，主要以酸降解為主，使用的酸包括鹽酸、草酸、硫酸、甲酸等。酸水解褐藻膠的機(jī)制主要包括以下三步：1）糖苷氧給予共軛酸質(zhì)子；2）共軛酸形成的非還原末端與碳-氧鎓離子斷裂；3）水分子迅速加入碳-氧鎓離子中形成還原末端（圖2）。早在1966年，Haug等[7]用1mol/L草酸在100℃下水解褐藻膠，將近30%的褐藻膠溶解。在PH2.85處分離得到可溶和不可溶的組分，可溶組分80%～90%為甘露糖醛酸片段：不可溶組分80%～90%為古羅糖醛酸片段。所得到的褐藻膠寡糖聚合度（degreeofpolymerization）從10～30不等。揭藻膠對無機(jī)酸有較強(qiáng)的耐受性，很難獲得全部水解的糖醛酸。因此酸降解法只能部分水解褐藻膠。雖然此方法降解褐藻膠效率較低，但為后人制備褐藻膠寡糖提供了參考。2001年Chamlia等[8]利用硫酸、甲酸和鹽酸分別對褐藻Le.ssoniutrabecuUita不同組織進(jìn)行了處理。結(jié)果顯示利用90%甲酸在100℃反應(yīng)6h，接著用1.5N甲酸在100℃處理2h即可將褐藻膠全部水解。這種方法比傳統(tǒng)的硫酸/鹽酸處理法更清潔快速，而且水解產(chǎn)物的G/M比率更低。

除了酸降解法外，堿降解法也是化學(xué)法中不可缺少的一部分，其降解機(jī)理與酶降解法相似：1985年，Niemela等[9]利用堿在95℃和135℃處理褐藻膠，發(fā)現(xiàn)有類似于糖精酸的二元酸和一元酸生成。高濃度的堿促進(jìn)葡異糖精酸、脫水異糖精酸和2-脫氧-3-C-甲基酒石酸的形成，而在低濃度的堿存在的條件下2，3-二脫氧戊糖酸為主要產(chǎn)物。從反映產(chǎn)物的性質(zhì)來看，褐藻膠被直接降解或內(nèi)部連接斷裂后被降解。在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)經(jīng)一定濃度的高碘酸處理后的褐藻膠高度敏感于堿催化的/？-消去反應(yīng)，甚至在生理?xiàng)l件下（PH7.4.37t）也可發(fā)生降解。在褐藻膠中，氧化發(fā)生在M和G末端C2和C3之間，生成的二元醛易在堿中降解。氧化后形成的二元醛自由能為88kJ/mol，而非氧化末端自由能為113kJ/mol，因而經(jīng)高碘酸處理后的褐藻膠更易在堿性條件下發(fā)生β消去反應(yīng)[10]。這一發(fā)現(xiàn)將拓展褐藻膠及其寡糖衍生物在生物材料及組織工程中的應(yīng)用

楊釗等[11]建立了一種新的褐藻膠寡糖制備方法，即氧化還原法。PolyM經(jīng)過5%過氧化氫，在90℃下反應(yīng)2h后，可得到聚合度為3-11的寡糖。通過圓二色譜和紅外光譜結(jié)果得出，氧化降解法制備的寡糖仍保持甘露糖醛酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的酸降解法相比，氧化降解法制備的寡糖色澤潔白，產(chǎn)率和純度較高，并且降解反應(yīng)快速。“三廢”污染少，對于工業(yè)化生產(chǎn)具有一定參考價值。2010年，Li等[12]利用過氧化氫降解褐藻膠，獲得了低相對分子質(zhì)量的褐藻膠寡糖。研究結(jié)果顯示，降解率取決于反應(yīng)時間、溫度、溶液PH值以及過氧化氫的濃度。利用過氧化氫處理褐藻膠導(dǎo)致糖鏈明顯減短，并在C-1還原端形成醛基然而過激的反應(yīng)會促進(jìn)寡聚物羧基的形成。氧化后的褐藻膠形成的鈣交聯(lián)支架要比未加修飾的電易降解，這表明經(jīng)過氧化氫處理后的褐藻膠可用于能進(jìn)行生物降解的組織工程和藥物傳輸。

化學(xué)降解法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如生產(chǎn)成本低、技術(shù)成熟、反應(yīng)機(jī)理明確等；但也存在許多問題，如方法操作步驟繁瑣、需要使用刺激性的化學(xué)試劑、反應(yīng)劇烈、易腐蝕設(shè)備、造成環(huán)境污染，制備的褐藻膠寡糖產(chǎn)量較低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求等。

1.2物理降解法

物理降解法主要是通過微波輻射、紫外線照射以及高溫高壓等物理方法降解褐藻膠。輻射是一種降解多聚物的有效手段[14]。與化學(xué)降解法相比，輻射法對褐藻膠的降解能力更強(qiáng)，更容易獲得低相對分子質(zhì)量的褐藻膠寡糖[15]。先前就有科學(xué)家利用輻射的方法降解纖維素中的糖苷鍵[16]。2000年，Nagasawa等[17]利用Co60伽馬射線處理褐藻膠固體和褐藻膠水溶液，并在20～500kGy劑量范圍內(nèi)研究了射線對褐藻膠的影響。結(jié)果表明褐藻膠水溶液較固體褐藻膠更易降解，這與溶液中水分子的自由基有密切關(guān)系。高度降解的褐藻膠顏色發(fā)生變化，這是由于糖鏈斷裂在吡喃糖環(huán)形成雙鍵造成的。2014年，Naeem等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)Co60放射處理的褐藻膠可以提高薄荷的葉面積，從而獲得更多光照機(jī)會，增加植物干重。以上研究表明，輻射可以有效降解褐藻膠，得到的褐藻膠寡糖具有促進(jìn)植物生長活性的作用，這為其在綠色農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

紫外照射法是一種新塑的降解褐藻膠方法。在光催化劑二氧化鈦存在的條件下，紫外照射褐藻酸鈉水溶液3h以上可部分水解褐藻酸鈉。降解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量較低，G/M比率與酸降解法產(chǎn)物相似[19]。這種方法的優(yōu)勢在于不需要特殊的設(shè)備，不需要對溫度的嚴(yán)格控制以及二氧化鈦易除去，能獲得較純的產(chǎn)物。然而紫外照射法的降解效率過低，反應(yīng)機(jī)理不明確，仍需做進(jìn)一步研究改進(jìn)，以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

超臨界水是溫度和壓力均超過其臨界點(diǎn)值（臨界溫度374.15°C，臨界壓力22.05MPa）的水，其物理化學(xué)性質(zhì)有很大變化，氫鍵、密度、粘度和介電常數(shù)都大幅度減小，擴(kuò)散系數(shù)較大，傳質(zhì)性能好[20、21]。因此超臨界水可以代替環(huán)境不友好的溶劑，是一種新型反應(yīng)介質(zhì)。以超臨界水為介質(zhì)，在極短時間內(nèi)便可完全降解褐藻膠，糖苷鍵和己糖環(huán)被破壞，形成復(fù)雜的混合物：以亞臨界水為介質(zhì)，在25MPa，523K條件下反應(yīng)88ms，便可獲得純度為98%的PolyG和富含M的PolyMG水溶液。通過對反應(yīng)時間和溫度的控制，可調(diào)節(jié)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量及G/M比率[22]。這種以超臨界水和亞臨界水為介質(zhì)降解褐藻膠的方法與傳統(tǒng)方法相比，反應(yīng)極為迅速，使用的設(shè)備精密，對反應(yīng)過程的可操控性強(qiáng)在以亞臨界水為介質(zhì)時，褐藻膠內(nèi)M-G和G-M連接被選擇性降解，適用于大量制備高純度的Poly G。

2010年，Aida等[23]對褐藻膠進(jìn)行熱處理（180～250℃）。結(jié)果表明，褐藻膠在高溫條件下降解，起初釋放甘露糖醛酸（M），然后釋放古羅糖醛酸（G）同時發(fā)現(xiàn)，單糖是通過具有選擇性斷裂M-M、M-G、G-G之間的糖苷鍵形成的，而不是在褐藻膠中隨機(jī)斷裂生成的。隨著溫度的增加，促進(jìn)褐藻膠降解反應(yīng)，但是單糖產(chǎn)量會隨之降低，最后生成乳酸和乙醇酸等有機(jī)酸。此后該課題組又對褐藻膠進(jìn)行高溫水熱處理，獲得了甲酸、乙酸、乳酸以及乙醇酸等多種有機(jī)酸。結(jié)果顯示在350℃，40MPa條件下反應(yīng)0.7s可得46%的有機(jī)酸。有機(jī)酸的生成說明在進(jìn)行水熱處理過程中，褐藻膠結(jié)構(gòu)中的羧基未被破壞，而二羧酸的形成說明發(fā)生了氧化反應(yīng)；同時，降解產(chǎn)物的分布說明水熱處理過程中既有酸催化反應(yīng)又有堿催化反應(yīng)[24]。通過對熱處理反應(yīng)機(jī)制的深入研究，只要對反應(yīng)條件適當(dāng)調(diào)整，就可獲得同源性多聚糖、褐藻膠寡糖以及單糖（M、G）。熱處理法不需要用刺激性的化學(xué)試劑，操作簡單，反應(yīng)快速而且具有一定特異性，為褐藻膠寡糖特別是單糖的生產(chǎn)開辟了一條新道路。

2013年Hu等[25]發(fā)明了一種制備褐藻膠寡糖的方法，即快速微波放射法將褐藻膠水解產(chǎn)物PolyG置于130℃，1600W微波輻射下降解15min，便得到古羅糖酵酸寡糖（guluronicacidoligosac-rharides）混合物。經(jīng)過分離，得到聚合度從1?10不等的古羅糖酵酸寡糖，產(chǎn)量高達(dá)71%。這種方法不僅簡單快速，反應(yīng)條件易控制，而且得到混合物僅需要一步純化便可得到不同聚合度的寡糖。ESI-MS和NMR分析得出微波降解法獲得的寡糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與酸水解法得到的寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。

綜上所述，物理法降解褐藻膠制備褐藻膠寡糖具有操作簡單、反應(yīng)迅速、無環(huán)境污染等優(yōu)勢，彌補(bǔ)了化學(xué)法制備褐藻膠寡糖的不足，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

1.3酶解法

褐藻膠裂解酶通過β-（1.4）消去反應(yīng)降解褐藻膠，并在非還原端形成一個在235nm處有特征吸收峰的不飽和糖酸酸殘基。褐藻膠裂解酶按其底物專一性不同可分為PolyM酶、PolyG酶和PolyMG酶；按其作用方式可分為內(nèi)切酶和外切酶[26]。褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制與C5-差向異構(gòu)酶的催化機(jī)制非常相近，包括三步反應(yīng)：1）中和羥基陰離子上的負(fù)電荷；2）從C5上獲得質(zhì)子；3）羧基基團(tuán)提供電子在C4與C5之間形成雙鍵，導(dǎo)致了發(fā)生在4-O-糖苷鍵的β-消去反應(yīng)。在差向異構(gòu)酶的作用機(jī)制中，第三步被C5上的質(zhì)子置換反應(yīng)所替代[27、28]（圖3）。

近年來，不同來源不同類型的褐藻膠裂解酶的相繼發(fā)現(xiàn)以及對褐藻膠裂解酶的深入研究，推動了褐藻膠裂解酶制備領(lǐng)域的發(fā)展。Zhang等[29]分離并純化了來自Vibmsp.510的褐藻膠裂解酶，水解褐藻膠24h，經(jīng)乙醇沉淀，低壓凝膠滲透色譜，半制備強(qiáng)陰離子快速蛋白液相色譜獲得了聚合度2～5的7種不同的褐藻膠寡糖，并用ESIMS和2DNMR技術(shù)闡明了寡糖結(jié)構(gòu)。2010年，Li等[30]利用來自Pseudomonassp.HJZ216的褐藻膠裂解酶降解褐藻膠。降解產(chǎn)物經(jīng)離子交換色譜分離純化得到6種寡糖，其中包括二糖和三糖等低聚寡糖：2012年，Lee等[31]Stenotrophomasmal-tophiliaKJ-2中克隆并純化出一種新的褐藻膠裂解酶。對酶解產(chǎn)物的NMR分析顯示，降解后獲得的褐藻膠寡糖在還原端存在甘露糖醛酸（M），這說明這種酶更偏好降解M-G之間的糖苷鍵，是具有PolyMG特異性的褐藻膠裂解酶。將它與PolyM酶、PolyG和外切酶共同使用，可制備出不同結(jié)構(gòu)的褐藻膠寡糖及單糖。

雖然迄今為止報道的褐藻膠裂解酶種類較多，但外切型的褐藻膠裂解酶僅有3種[32-34].外切酶對于寡糖鏈的修飾、褐藻膠寡糖和單糖的制備起著重要作用。2012年，Hee等從Saccharophagusdegradcms2-40中克隆出外切型褐藻膠裂解酶Alg17C。Algl7C屬于PL-17家族，可將聚合度大于2的褐藻膠寡糖降解為褐藻膠單糖（4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronicacid，DEH）。經(jīng)過分析推測，Algl7C的反應(yīng)機(jī)理為以下三步：1）酶結(jié)合到褐藻膠鏈末端；2）識別末端兩個以上的寡糖單位；3）通過酶活性位點(diǎn)在底物上滑動剪切釋放單體。對外切型褐藻膠寡糖的深入研究，將為海藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料和化學(xué)制劑提供理論基礎(chǔ)。

與化學(xué)降解法和物理降解法相比，酶解法具有反應(yīng)更加溫和、底物專一性強(qiáng)、產(chǎn)量較高、副產(chǎn)物少、環(huán)境友好等優(yōu)勢。因此，酶解法是目前制備褐藻膠寡糖的主要方法。

2展望

隨著對海洋開發(fā)的不斷深入，人們對褐藻膠寡糖的認(rèn)識也越來越全面和深入。褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)獨(dú)特，因其具有特殊的生理活性和物理化學(xué)性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于保健食品、綠色農(nóng)業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。尤其是在藥物傳輸和組織工程能方面，褐藻膠寡糖作為一種新型極具潛力的生物材料而備受關(guān)注。然而，目前對褐藻膠寡糖的生物活性機(jī)理的研究并不是很系統(tǒng)，因此對不同結(jié)構(gòu)褐藻膠寡糖的制備及其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系亟待研究。2012年，Aarstad等[36]對海藻中G、M的分布和比例進(jìn)行了初步研究，并用褐藻膠裂解酶構(gòu)建了聚合物為2-15的寡糖庫，為今后研究褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系打下良好基礎(chǔ)。

另一方面，以大型海藻生物質(zhì)為原料的第三代生物乙醇時代已經(jīng)到來。褐藻膠是褐藻中的主要成分，可達(dá)干重的30%以上。綜合運(yùn)用物理化學(xué)和生物的方法降解多聚糖將成為海藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的關(guān)鍵。已有報道利用輻射-過氧化氫、堿-熱處理魔芋中葡甘聚糖，獲得低相對分子質(zhì)量、低粘度的功能性寡糖[37、38]。此外，褐藻膠裂解酶及C5-異構(gòu)酶的剪切修飾作用[39、40]，將進(jìn)一步提高褐藻膠的降解效率并拓展褐藻膠寡糖的應(yīng)用領(lǐng)域。因此，綜合運(yùn)用各種方法制備褐藻膠寡糖及單糖必將成為未來的研究熱點(diǎn)，對于寡糖生物活性的探索及其在生物能源領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

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