林芳花等

摘要[目的]比較研究海馬等8種海洋中藥體外抗氧化活性。[方法]測(cè)定高錳酸鉀還原所需的氧化時(shí)間；采用光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子，并測(cè)定清除率；采用普魯士藍(lán)法測(cè)定總還原力。[結(jié)果] 氧化時(shí)間從短到長(zhǎng)順序：海馬<海龍<海藻<龜甲膠<海螵蛸<龜甲<牡蠣<瓦楞子，其中海馬氧化時(shí)間21.2 s，與Vc相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。超氧陰離子清除率大小順序：海螵蛸>龜甲膠>海龍>海馬>海藻>龜甲>牡蠣>瓦楞子，其中海螵蛸清除率42.21%，與Vc相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。總還原力強(qiáng)弱順序：龜甲膠>海龍>海馬>海藻>牡蠣>海螵蛸>龜甲>瓦楞子。[結(jié)論]海馬、海龍、海螵蛸、海藻、龜甲和龜甲膠的抗氧化活性較高，但效果均不及Vc，瓦楞子、牡蠣抗氧化活性較低，龜甲膠抗氧化活性高于龜甲。

關(guān)鍵詞海馬；海洋藥物；抗氧化活性

中圖分類號(hào)S986.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）29-073-02

海洋中藥是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下用于防病治病和養(yǎng)生保健的物質(zhì)，其來(lái)源包括生活于海水、海底泥灘或巖石、淺海沙灘的動(dòng)物、植物及海洋中的礦物，也包括生活于海洋周圍的、以海洋生物為食的鳥類?！吨兴幋筠o典》記載海洋中藥共134種，海洋中藥的研究、開發(fā)與應(yīng)用滯后于陸地來(lái)源中藥。海洋生物生存環(huán)境特殊，具有陸地生物所沒有的化學(xué)成分，種類繁多、資源豐富，可再生性強(qiáng)，發(fā)展?jié)摿薮螅陙?lái)其研究熱點(diǎn)集中在海洋活性產(chǎn)物的研究與開發(fā)、海洋微生物的研究與開發(fā)、海洋生物基因工程技術(shù)等方面。健康長(zhǎng)壽是人類幸福的永恒主題，而抗氧化延緩衰老是現(xiàn)代生物科學(xué)研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一[2-4]，目前有關(guān)海洋中藥抗氧化活性的研究報(bào)道較少?；诖?，筆者研究并比較了8種常用海洋中藥的體外抗氧化活性，以初步評(píng)價(jià)其活性。

1材料與方法

1.1藥材

海馬等8種中藥于2014年10月購(gòu)自廣東省惠州市惠城區(qū)北京同仁堂藥店，經(jīng)惠州學(xué)院生命科學(xué)系林芳花副教授檢定，符合2010年版《中國(guó)藥典》質(zhì)量要求，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，備用。

1.2儀器

FA1104N電子天平（上海精天電子儀器有限公司，精度0.1 mg）、PH050型電熱恒溫干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）、HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、KH3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、HSX250恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）、UV2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、SPX300BG型光照培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3試藥

維生素C（Vc）、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氮藍(lán)四唑（NBT）、核黃素、蛋氨酸、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、高錳酸鉀、濃硫酸、鹽酸等均為分析純。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1對(duì)照品溶液的制備。

取Vc 0.05 g，精密稱定后置于50 ml量瓶中，加水至刻度，使其溶解并搖勻，備用。

1.4.2樣品溶液的制備。

取藥材粉末各5 g，精密稱定后置于100 ml錐形瓶中，加入50%乙醇50 ml，靜置30 min，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz，50 ℃）30 min，過(guò)濾后將濾液置于50 ml量瓶中，加水至刻度后搖勻，備用。

1.4.3氧化時(shí)間的測(cè)定。

參照2010年版《中國(guó)藥典》方法并經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)，測(cè)定氧化時(shí)間。精密量取續(xù)濾液10 ml，置于具塞錐形瓶中，立即加入20%硫酸溶液2 ml，振蕩1 min，立即加入0.02 mol/L高錳酸鉀溶液0.05 ml，開始計(jì)時(shí)，直至溶液中紫紅色完全消退時(shí)停止。

1.4.4超氧陰離子清除率的測(cè)定。

參照文獻(xiàn)[6]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，測(cè)定超氧陰離子清除率。以0.105 mol/L pH 74的PBS緩沖液為溶劑，配制1.67×10-5 mol/L核黃素，0.01 mol/L蛋氨酸，9.2×10-5 mol/L NBT。分別吸取上述3種溶液各2 ml，加入樣品溶液1.0 ml，置于光照培養(yǎng)箱中光照30 min，以緩沖液為對(duì)照，于波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定吸光度，按照以下公式計(jì)算超氧陰離子清除率：

超氧陰離子清除率（%）=（A0-A樣）/ A0×100%（1）

式中，A0為對(duì)照溶液的吸光度，A樣為樣品溶液的吸光度。

1.4.5總還原力的測(cè)定。

參照文獻(xiàn)[6]的方法并經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)，測(cè)定總還原力。取樣品溶液0.1 ml，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液2.5 ml，加入1%鐵氰化鉀K3[Fe（CN）6]溶液5.0 ml，置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 ml，加入水2.5 ml，加入0.1%的氯化鐵溶液0.5 ml并混勻，室溫下放置10 min，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.1氧化時(shí)間

高錳酸鉀發(fā)生還原反應(yīng)，Mn7+變?yōu)镸n2+，溶液由紫紅色變?yōu)闊o(wú)色，褪色時(shí)間越短，表明待測(cè)樣品抗氧化活性越強(qiáng)。由表1可知，氧化時(shí)間順序?yàn)楹ｑR<海龍<海藻<龜甲膠<海螵蛸<龜甲<牡蠣<瓦楞子，其中海馬所需時(shí)間最短，與Vc相比無(wú)顯著差異（P>0.05），海龍、海藻和龜甲膠的氧化時(shí)間較短，但與Vc相比差異顯著（P<0.05），海螵蛸、龜甲、牡蠣和瓦楞子的氧化時(shí)間較長(zhǎng)，與Vc相比差異極顯著（P<0.01）。

2.2超氧陰離子清除率

超氧陰離子將NBT還原為藍(lán)紫色物質(zhì)，在波長(zhǎng)560 nm處有最大吸收峰，采用光照核黃素的方法產(chǎn)生超氧陰離子，在抗氧化劑作用下超氧陰離子因?yàn)榘l(fā)生歧化反應(yīng)而減少，對(duì)NBT的還原作用減弱，測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率，可以間接反映待測(cè)樣品的抗氧化活性。由表1可知，超氧陰離子清除率大小順序?yàn)楹ｓ?龜甲膠>海龍>海馬>海藻>龜甲>牡蠣>瓦楞子，其中海螵蛸清除能力最強(qiáng)，與Vc相比無(wú)顯著差異（P>0.05），龜甲膠、海龍、海馬、海藻、龜甲的清除能力較強(qiáng)，但與Vc相比有顯著差異（P<005），牡蠣和瓦楞子的清除能力較弱，與Vc相比差異極顯著（P<0.01）。

2.3總還原力

鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，與Fe3+反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在波長(zhǎng)700 nm處有最大吸收峰，吸光度越大表示待測(cè)樣品的還原力越強(qiáng)，即抗氧化活性越高?？傔€原力強(qiáng)弱順序?yàn)辇敿啄z>海龍>海馬>海藻>牡蠣>海螵蛸>龜甲>瓦楞子，8種樣品總還原力均弱于Vc。

3討論

筆者通過(guò)測(cè)定氧化時(shí)間、超氧陰離子清除率和總還原力，對(duì)比海馬等8種常用海洋中藥的體外抗氧化活性，用不同作用機(jī)制來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，海馬、海龍、海螵蛸、海藻、龜甲、龜甲膠的氧化時(shí)間較短，超氧陰離子清除率較高，總還原力也較強(qiáng)，表明其抗氧化活性較高，但總體上均弱于Vc，而瓦楞子和牡蠣的抗氧化活性較低。

謝學(xué)明等研究了龜甲石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取部位的體外抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇部位的抗氧化活性最高。黃春花等發(fā)現(xiàn)海南產(chǎn)龜板的抗氧化活性高于湖北漢陽(yáng)產(chǎn)龜板，但未明確龜甲抗氧化活性成分，而龜甲膠的抗氧化活性研究尚未見報(bào)道。該試驗(yàn)中龜甲和龜甲膠在氧化時(shí)間、超氧陰離子清除率、總還原力3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)都表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，且龜甲膠的抗氧化活性高于龜甲，分析其原因可能是龜甲膠經(jīng)煎煮、濃縮后，單位重量中所含抗氧化活性成分多于龜甲，由于試驗(yàn)條件和時(shí)間所限，筆者未對(duì)龜甲和龜甲膠的抗氧化活性成分進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 文艷.海洋藥物研發(fā)現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)分析[J].中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，2006（3）：43-49.

[2] RODRIGUES E，MARIUTTI L R B，MERCADANTE A Z.Scavenging capacity of marine carotenoids against oxygen and nitrogen species in a membrane-mimicking system[J].Marine drugs，2012，10（8）：1784-1798.

[3] GONZLEZ P M，MALANGA G，PUNTARULO S.Cellular Oxidant/Antioxidant network： update on the environmental effects over marine organisms[J].The open marine biology，2015，9（1）：1-13.

[4] ALAM M N，BRISTI N J，RAFIQUZZAMAN M.Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity [J].Saudi pharmaceutical，2013，21（2）：143-152.

[5] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：第一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：336-337.

[6] 林芳花，彭永宏，張啟斌，等.荔枝不同部位的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011，23（4）：310-313.

[7] 謝學(xué)明，李熙燦，鐘遠(yuǎn)聲，等.龜板體外抗氧化活性的研究[J].中國(guó)藥房，2006，17（18）：1368-1370.

[8] 黃春花，李熙燦，陳東風(fēng).兩種不同產(chǎn)地龜甲抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（5）：820-830.

[9] 杜沛霖，周雨晴，朱華.龜甲的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：11319-11320，11338.