顧文亮等

摘 要 香草蘭果莢發(fā)育中存在嚴(yán)重的果莢脫落現(xiàn)象，對(duì)香草蘭果莢脫落情況及其內(nèi)源激素含量變化進(jìn)行探討，以期解決目前生產(chǎn)上果莢脫落率高的問(wèn)題。設(shè)疏果后保留1個(gè)、8～10個(gè)香草蘭果莢以及未疏果共3種處理，從果莢發(fā)育至脫落的60 d內(nèi)分期取材，采用酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定各處理果莢中生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素核苷（ZR）和脫落酸（ABA）的含量。結(jié)果表明：3種處理的果莢脫落率與保留果莢數(shù)目呈正相關(guān)； IAA和ZR的含量在前期較高，ABA的含量在中、后期較高，GA的含量一直維持在較低的水平；較高的IAA/ABA 和（IAA+GA+ZR）/ABA比值有利于控制果莢脫落；疏果處理有利于坐果的激素平衡，而保留過(guò)多的果莢則不利于形成激素平衡。本研究可為解決生產(chǎn)中的香草蘭落莢問(wèn)題提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞 香草蘭；果莢脫落；內(nèi)源植物激素

中圖分類號(hào) S682.31，S311 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Pod abscission in Vanilla is very serious during pod development. In order to solve this problem， the changes of endogenous plant hormones and pod abscissions under different fruit load were examined in this study. Three levels of fruit load after pollination were set by fruit thinning i.e. 1，8-10 and all vanilla pods were retained as control. The contents of IAA，GA，ZR and ABA in pods from day 0 to day 60 after pollination were measured using enzyme-linked immunoassay. The results showed that the pod abscission rates of three fruit load treatments were positively correlated with the numbers of pods that retained. The contents of IAA and ZR were higher in earlier stage. while ABA content was higher in the middle and late stage，and GA content maintained a relatively low level.The higher ratio of IAA/ABA and（IAA+GA+ZR）/ABA were related to less pod abscission. Proper adjustment of fruit load may generated a hormone balance for pod retention. This study will provide theoretical basis for solving the problem of vanilla pod abscission during its production.

Key words Vanilla planifolia Andrews；Pod obscission；Endogenous plant hormones

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.018

墨西哥香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是蘭科（Orchidaceae）香草蘭屬（Vanilla）的熱帶攀援藤本植物，具有長(zhǎng)勢(shì)快、產(chǎn)量高和果莢品質(zhì)好等特點(diǎn)，其栽培面積占世界香草蘭栽培總面積的90%以上[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，墨西哥香草蘭的總種植面積在8萬(wàn)hm2以上，鮮豆莢的總產(chǎn)量可達(dá)9 000 t[2]。墨西哥香草蘭豆莢經(jīng)發(fā)酵生香加工后含有250多種揮發(fā)性芳香成分，可用于香煙、名酒、茶葉及香水等高端的食品和化妝行業(yè)中，僅發(fā)酵后的豆莢年產(chǎn)值就可達(dá)20億美元[3]。中國(guó)于20世紀(jì)60年代初從國(guó)外引種墨西哥香草蘭，目前在海南和云南等地有一定的種植面積，且取得了較高的經(jīng)濟(jì)效益[4]。近年來(lái)，隨著海南國(guó)際旅游島的建設(shè)以及海南國(guó)際香島的規(guī)劃，中國(guó)香草蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展正處于一個(gè)新的上升階段[5]。

在國(guó)內(nèi)外的香草蘭生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，香草蘭存在著嚴(yán)重的授粉后果莢脫落現(xiàn)象，其落莢率可達(dá)40%～60%[6]。根據(jù)香草蘭產(chǎn)量的通徑分析，果莢脫落是影響香草蘭果莢產(chǎn)量的主要因素[7]。香草蘭的花經(jīng)人工授粉后，其果莢在35 d內(nèi)迅速生長(zhǎng)發(fā)育，至45 d時(shí)果莢基本定形并停止生長(zhǎng)，此時(shí)果莢出現(xiàn)大規(guī)模的脫落現(xiàn)象。香草蘭果莢在脫落前先是表皮失去光澤并棱角明顯，而后果莢末端或基部出現(xiàn)黃化，同時(shí)在果莢與果柄的連接處發(fā)生離層脫落[8]。當(dāng)前的研究一般認(rèn)為，香草蘭的落莢主要是由于植株內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)不平衡而導(dǎo)致的生理性落果，此外，光照直射、蔭蔽度過(guò)大、高溫降雨和幼莢染病等因素都會(huì)導(dǎo)致香草蘭果莢脫落[9]。植物體的花、葉和果等器官脫落過(guò)程受到眾多因素的誘導(dǎo)，而所有外在因素的誘導(dǎo)均是通過(guò)一系列內(nèi)在因素實(shí)現(xiàn)的[10]。內(nèi)源植物激素在植物器官的脫落過(guò)程中起著重要的作用，其中乙烯起著誘導(dǎo)脫落的作用，而生長(zhǎng)素則通過(guò)與乙烯相拮抗起著抑制脫落的作用，內(nèi)源植物激素之間通過(guò)相互作用構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]。在國(guó)內(nèi)外的香草蘭果莢脫落研究中，多集中于利用外源人工生長(zhǎng)素2，4-D控制落莢的栽培措施，而關(guān)于香草蘭果莢發(fā)育至脫落過(guò)程中的內(nèi)源植物激素研究尚處于空白。本研究擬通過(guò)分析內(nèi)源植物激素在香草蘭果莢發(fā)育至脫落過(guò)程中的變化特征，為解決生產(chǎn)中的香草蘭落莢問(wèn)題提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株為生長(zhǎng)3 a以上的墨西哥香草蘭（V. planifolia Andrews），種植于海南省萬(wàn)寧市南橋六甲的中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所基地中，均在蔭蔽條件下露地栽培。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)處理與采樣 設(shè)3種保留香草蘭果莢數(shù)量的處理：處理1（ET-1）為香草蘭花序上授粉1朵花后保留1個(gè)果莢；處理2（ET-2）為香草蘭花序上授粉8～10朵花后保留8～10個(gè)果莢；處理3（ET-3）為在香草蘭花序上連續(xù)對(duì)全部花朵授粉后保留全部的果莢即13個(gè)以上的果莢。在授粉后的10～60 d內(nèi)，每隔10 d于3種處理中各選6株香草蘭供試植株，每株上均只處理1個(gè)花序；同時(shí)，每隔10 d對(duì)上述3種處理中的香草蘭果莢進(jìn)行取樣。以未經(jīng)任何疏花疏果處理的在40～50 d時(shí)自然脫落的果莢為對(duì)照，將其中的內(nèi)源激素含量與同時(shí)期3種處理下的未脫落果莢進(jìn)行對(duì)比。每種處理分別從不同香草蘭植株上取6個(gè)以上的果莢，用液氮快速冷凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 果莢脫落的觀測(cè) 設(shè)置3種保留香草蘭果莢數(shù)量的處理，處理1（ET-1）、處理2（ET-2）和處理3（ET-3）同上。3種處理均設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)均隨機(jī)設(shè)3個(gè)處理，各個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)的每個(gè)處理選30株香草蘭供試植株，每株上均只處理1個(gè)花序。在授粉后的60 d時(shí)分別統(tǒng)計(jì)不同試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)3種處理的果莢脫落率。

1.2.3 果莢內(nèi)源激素含量的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）分別測(cè)定各處理的香草蘭果莢中生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素核苷（ZR）和脫落酸（ABA）的含量，植物激素含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。（1）稱取0.5 g香草蘭組織樣品，加入2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，再用2 mL提取液分2次將研缽沖洗干凈，將沖洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中，搖勻后置于4 ℃冰箱中提取4 h，在3 500 r/min下離心8 min，取上清液；（2）于沉淀中加1 mL提取液并攪勻，置于4 ℃中再提取1 h，同條件下離心8 min，合并上清液并記錄體積；（3）將上清液過(guò)C-18固相萃取柱后轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，用氮?dú)鈨x吹干，除去提取液中的甲醇后即為植物激素樣品，用2 mL樣品稀釋液定容，將其置于-20 ℃中封口保存；（4）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、洗板、加二抗、洗板、加底物顯色、比色等步驟分別測(cè)定各激素含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)與圖表，采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果莢脫落率的觀測(cè)

由表1可知，處理1、處理2和處理3的平均果莢脫落率分別為41.11%、52.34%和64.48%。香草蘭的果莢脫落高峰期一般在授粉后40～50 d之間，在60 d后果莢基本停止脫落，由此可見(jiàn)處理1的果莢脫落率最低，處理2的果莢脫落率較高，處理3的果莢脫落率最高，且3種處理間的平均果莢脫落率均呈顯著差異。

2.2 不同疏果處理下果莢的內(nèi)源激素含量變化特征

2.2.1 IAA含量的變化特征 由圖1可知，在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10、20 d時(shí)處理3的IAA含量與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1與處理2之間無(wú)顯著差異；在30、50 d時(shí)處理1與處理2、處理3間均呈顯著差異，但處理2與處理3之間均無(wú)顯著差異；在40、60 d時(shí)3種處理之間無(wú)顯著差異。在10、20 d的幼果莢期，處理3由于授粉果莢數(shù)量多，故其果莢中的IAA含量顯著高于處理1和處理2。

2.2.2 GA含量的變化特征 由圖2可知，在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10 d時(shí)處理3的GA含量與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異；在20 d時(shí)處理1、處理2與處理3間均呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異；在30、40 d時(shí)3種處理之間均呈顯著差異；在50 d時(shí)處理1與處理2、處理3間呈顯著差異，但處理2和處理3之間無(wú)顯著差異；在60 d時(shí)處理3與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異。GA具有刺激果實(shí)生長(zhǎng)，提高結(jié)實(shí)率的效果，故處理1的未脫落果莢中的GA含量均顯著高于處理2和處理3，且落莢率越低則GA含量越高。

2.2.3 ZR含量的變化特征 由圖3可知，在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10 d時(shí)處理3的ZR含量與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異；在20 d時(shí)處理1、處理2與處理3之間均呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異；在30 d時(shí)處理1與處理2、處理3間均呈顯著差異，但處理2與處理3之間無(wú)顯著差異；在40、50 d時(shí)3種處理之間均無(wú)顯著差異；在60 d時(shí)處理1、處理3與處理2間均呈顯著差異，但處理1和處理3之間無(wú)顯著差異。在授粉10 d的幼果莢期，處理3由于授粉果莢數(shù)量多，故其果莢中的ZR含量顯著高于處理1和處理2。

2.2.4 ABA含量的變化特征 由圖4可知，在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10 d時(shí)處理3的ABA含量與處理1、處理2間均呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異；在20 d時(shí)處理1與處理2、處理3間均呈顯著差異，但處理2與處理3之間無(wú)顯著差異；在30、40、50 d時(shí)3種處理之間無(wú)顯著差異；在60 d時(shí)處理3與處理1、處理2間均呈顯著差異，但處理1和處理2之間無(wú)顯著差異。

2.3 脫落果莢與未脫落果莢的內(nèi)源激素含量對(duì)比分析

由表2可知，處理1的內(nèi)源IAA含量顯著高于脫落果莢，但處理2、處理3與脫落果莢之間均無(wú)顯著差異。處理1、處理2和處理3的內(nèi)源GA含量均顯著高于脫落果莢。處理1、處理2和處理3的內(nèi)源ZR、ABA含量均顯著低于脫落果莢。脫落酸具有促進(jìn)果實(shí)脫落的效果，故3種處理的未脫落果莢中的ABA含量均顯著低于脫落果莢。

2.4 不同疏果處理下果莢的內(nèi)源激素比值變化特征

2.4.1 IAA與ABA的比值變化特征 由圖5可知，在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10、60 d時(shí)3種處理的 IAA/ABA比值之間無(wú)顯著差異；在20 d時(shí)3種處理之間均呈顯著差異；在30 d時(shí)處理1與處理2、處理3間呈顯著差異，但處理2與處理3之間無(wú)顯著差異；在40 d時(shí)處理3與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1與處理2之間無(wú)顯著差異；在50 d時(shí)處理1與處理2、處理3間呈顯著差異，但處理2與處理3之間無(wú)顯著差異。

2.4.2 IAA、GA、ZR總和與ABA的比值變化特征 由圖6可知， 在香草蘭的果莢發(fā)育過(guò)程中，在授粉10 d時(shí)處理1、處理2和處理3的（IAA+GA+ZR）/ABA比值之間均無(wú)顯著差異；在20、60 d時(shí)處理1、處理2和處理3之間均呈顯著差異；在30 d時(shí)處理1與處理2、處理3間呈顯著差異，但處理2和處理3之間無(wú)顯著差異；在40 d時(shí)處理3與處理1、處理2間呈顯著差異，但處理1與處理2之間無(wú)顯著差異；在50 d時(shí)處理1與處理2、處理3間呈顯著差異，但處理2與處理3之間無(wú)顯著差異。

2.5 脫落果莢與未脫落果莢的相關(guān)內(nèi)源激素比值對(duì)比分析

將授粉后50 d的脫落果莢與未脫落果莢中的相關(guān)內(nèi)源激素比值進(jìn)行比較。由表3可知，此時(shí)處理1、處理2和處理3的IAA/ABA比值均顯著高于脫落果莢。另外，處理1、處理2和處理3的（IAA+GA+ZR）/ABA比值也均顯著高于脫落果莢。

3 討論與結(jié)論

植物體的花、葉和果等器官脫離母體過(guò)程是植物界普遍發(fā)生的生理現(xiàn)象，落花與落果問(wèn)題是影響多數(shù)作物產(chǎn)量與品質(zhì)的重要因素[12]。器官脫落過(guò)程受到眾多因素的誘導(dǎo)，而所有外在因素的誘導(dǎo)均是通過(guò)一系列內(nèi)在因素實(shí)現(xiàn)的。內(nèi)源植物激素通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)生理生化反應(yīng)，從而調(diào)控植物的器官脫落過(guò)程[13]。在本研究中，授粉后10 d的幼果莢期，果莢生長(zhǎng)迅速且細(xì)胞分裂旺盛，與果莢中的IAA和ZR含量較高相對(duì)應(yīng)；授粉40 d后的果莢穩(wěn)定期，果莢生長(zhǎng)停止且細(xì)胞分裂停止，處理2和處理3果莢中的IAA和ZR含量均有所下降；授粉后50 d的果莢脫落期，脫落果莢中的ABA含量顯著高于尚未脫落的正常果莢，但脫落果莢中的GA含量顯著低于尚未脫落的正常果莢。另外，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，IAA和ABA的絕對(duì)含量比GA和ZR的絕對(duì)含量高出許多，這說(shuō)明IAA、ABA和GA分別在香草蘭的果莢發(fā)育至脫落的不同時(shí)期起著關(guān)鍵作用。內(nèi)源植物激素對(duì)器官脫落的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在該過(guò)程中某一激素的消長(zhǎng)及其含量的變化僅僅只是一方面，而內(nèi)源植物激素的相互平衡及其相互的協(xié)同作用則顯得更為重要[14]。在本研究中，授粉后50 d的果莢脫落高峰期，尚未脫落的正常果莢的IAA/ABA和（IAA+GA+ZR）/ABA比值均顯著高于脫落果莢，這說(shuō)明IAA/ABA和（IAA+GA+ZR）/ABA的激素平衡對(duì)果莢的脫落發(fā)揮了重要作用。

在前期的香草蘭果莢脫落研究中，周如潺等[15]發(fā)現(xiàn)，在授粉后15～25 d用2，4-D涂抹果莢末端能夠控制果莢脫落；也有研究發(fā)現(xiàn)，在末花期人工噴霧2，4-D能夠控制果莢脫落[16]。但在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)現(xiàn)，香草蘭的花期較長(zhǎng)，且同一植株的不同花序上的花發(fā)育也不同步，在授粉后人工涂抹的方式僅適合小范圍使用，而在末花期進(jìn)行人工噴霧往往已經(jīng)錯(cuò)過(guò)果莢脫落高峰期，且容易造成藥害。因此，在香草蘭生產(chǎn)種植上通常采用控花疏果的防脫落栽培措施[17]。通過(guò)人為控制香草蘭的授粉果莢數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保留全部果莢的脫落率最高，處理2即保留8～10個(gè)果莢的脫落率次之，處理1即保留1個(gè)果莢脫落率則最低。在本研究中，處理3的IAA和ZR含量在授粉10 d時(shí)均顯著高于處理1和處理2，這說(shuō)明保留數(shù)量過(guò)多的果莢使得香草蘭植株在前期消耗大量營(yíng)養(yǎng)，用來(lái)合成大量的生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類激素；在授粉50 d時(shí)，處理2和處理3的IAA/ABA和（IAA+GA+ZR）/ABA比值均顯著高于脫落果莢（對(duì)照），但又顯著低于處理1，這說(shuō)明后期IAA/ABA和（IAA+GA+ZR）/ABA的激素平衡與果莢脫落率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，比值越高則果莢的脫落率越低。

目前，在香草蘭的生產(chǎn)種植上一般采用保留8～10個(gè)果莢的控花疏果措施，但較少采用噴施外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的保果措施。香草蘭通常在3月初花期和5月末花期時(shí)由于花序分化的質(zhì)量不高而導(dǎo)致成花數(shù)目較少，而且為了避免營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，在每株香草蘭上保留的花序數(shù)目也不宜過(guò)多。故筆者認(rèn)為，應(yīng)根據(jù)香草蘭在當(dāng)年的開(kāi)花情況，人為抹去在3月初和5月底萌發(fā)的花序，在每株香草蘭上僅保留2～3個(gè)花序，并在每個(gè)花序上授粉保留8～10個(gè)果莢。同時(shí)，結(jié)合本研究結(jié)果，筆者建議在4月中旬適量人工噴施含生長(zhǎng)素和赤霉素的外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，以期達(dá)到控制果莢脫落的目的。目前，噴施生長(zhǎng)素和赤霉素的含量以及噴施的時(shí)期尚需進(jìn)行深入研究，這也是本研究下一步的研究方向。

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