曾碧玉　常強(qiáng)　許傳俊

摘 要 以大花蕙蘭與墨蘭的雜交品種‘韓國(guó)小姐為母本，墨蘭品種‘企劍黑墨為父本進(jìn)行雜交，對(duì)其雜交坐果、落果情況及種子的無菌播種方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明：授粉后0～112 d落果較為嚴(yán)重，150 d時(shí)坐果率為62.1%。果莢采收時(shí)期及培養(yǎng)基對(duì)種子的無菌萌發(fā)影響顯著，種子在授粉后194 d采收，且于不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)萌發(fā)最佳。

關(guān)鍵詞 雜交蘭；墨蘭；雜交；坐果率；無菌播種

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cymbidium‘Miss Korea， the hybrid of Cymbidium hybridium and Cymbidium sinense， was crossed with Cymbidium sinense‘Qijian Heimo as male parent. The fruit set and drop and the aseptic seeding method of this cross combination were studied. The results showed that the fruit set was 62.1% on 150 days after pollination. The fruits dropped seriously during 0-112 days after pollination. Fruit harvesting time and nutrient media significantly influenced the germination frequency. Seeds， which harvested on 194 days after pollination， germinated best on half strength Murashige and Skoog（1/2MS） medium without plant growth regulators.

Key words Hybrid；Cymbidium sinense；Interspecies cross；Furit set；Aseptic seeding

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.011

大花蕙蘭（Cymbidium hybridium）與墨蘭（C. sinense）均屬蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）植物。大花蕙蘭為蘭屬植物中一部分大花附生種類及其雜交種[1]。株型高大優(yōu)美，花朵數(shù)多且排列整齊、花大色艷，具極高的觀賞價(jià)值。墨蘭為蘭屬地生蘭類植物，五大類傳統(tǒng)國(guó)蘭之一，其株型典雅、葉形花姿優(yōu)美、幽香四溢，深受人們喜愛。由于大多數(shù)大花蕙蘭多原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶高海拔地區(qū)，氣溫較冷涼。在國(guó)內(nèi)低海拔地區(qū)度夏較困難，且不具香味。而墨蘭原產(chǎn)于中國(guó)、越南和緬甸，具有清香典雅、株型及葉型優(yōu)美、易于栽培種植開花、耐熱且抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，常用墨蘭作親本用于培育優(yōu)良大花蕙蘭品種。

由于大花蕙蘭品種遺傳背景及其倍性復(fù)雜化，有二倍體、三倍體、四倍體及非整數(shù)倍體[2-4]，大花蕙蘭自交、品種間雜交及以大花蕙蘭為母本與墨蘭的雜交結(jié)果率均較低[2，4-9]，難以成功獲得雜交組合。而曾碧玉[2]研究結(jié)果顯示大花蕙蘭與墨蘭的雜交種為母本與墨蘭雜交，結(jié)實(shí)率可達(dá)76.2%。從中可推測(cè)，利用大花蕙蘭與墨蘭的雜交種為母本與墨蘭雜交，可大幅度提高雜交結(jié)實(shí)率，利于雜交組合的獲得。種子成熟度及生長(zhǎng)培養(yǎng)基是種子萌發(fā)的重要影響因子，這在蘭科植物不同屬中均普遍存在，如蘭屬[9-11]、石斛蘭屬（Dendrobium）[12-14]、兜蘭屬（Paphiopedilum）[15-17]、杓蘭屬（Cypripedium）[18-19]等。而即使在相同的大花蕙蘭與墨蘭種間雜交中，不同組合間果莢采收適期及生長(zhǎng)培養(yǎng)基均有所差異[2，8]，因此對(duì)不同雜交組合的種子采收適期及培養(yǎng)基均需要進(jìn)一步的摸索。

本研究選取大花蕙蘭與墨蘭雜交選育出的優(yōu)良品種‘韓國(guó)小姐（Cymbidium‘Miss Korea）為母本，與廣東四大墨蘭之一的‘企劍黑墨（C. sinense ‘Qijian Heimo）為父本進(jìn)行雜交，并對(duì)其雜交坐果、果莢生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)及種子萌發(fā)進(jìn)行研究，為蘭屬植物的雜交育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交蘭品種‘韓國(guó)小姐（Cymbidium‘Miss Korea）與墨蘭品種‘企劍黑墨（C. sinense‘Qijian Heimo）均從福建省廈門市亞熱帶花卉中心購(gòu)買，然后種植保存于福建省亞熱帶植物研究所蘭花資源圃內(nèi)?！n國(guó)小姐每盆假鱗莖4～6個(gè)，每個(gè)假鱗莖帶葉6～9片， 葉色翠綠； 花枝直立，長(zhǎng)53.0～58.0 cm； 每個(gè)花枝具13～16朵花，花徑5.0～6.0 cm； 花為桃紅色具縱紋線， 淡香?！髣谀颗?～8個(gè)假鱗莖，每個(gè)假鱗莖帶3～4片葉，葉色墨綠；花枝直立，長(zhǎng)34.0～56.0 cm； 每枝含花約6～11朵，花徑4.8～5.3 cm； 花為棕褐色并帶縱紋線，清香。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉及果莢大小測(cè)量 以 ‘韓國(guó)小姐為母本， ‘企劍黑墨 為父本進(jìn)行雜交。授粉時(shí)，母本取開花后3～4 d的花朵，先用鑷子去掉唇瓣及柱頭上的花粉塊，取待開放的父本花粉塊放置于母本的柱頭蕊腔內(nèi)；以上所用工具均用95%酒精消毒。授粉后，觀察記錄果莢的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)，并按一定時(shí)間間隔測(cè)量果莢大小，果長(zhǎng)計(jì)量為果莢基部至花萼著生處長(zhǎng)度，用軟尺測(cè)量。果寬計(jì)量為果莢最大直徑，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量。

1.2.2 無菌播種 取授粉后120、194、232 d果莢進(jìn)行無菌播種。果莢先用流水沖洗干凈，然后用75%酒精表面擦拭消毒，0.1%氯化汞消毒約10 min，最后用無菌水沖洗4～5次。將果莢內(nèi)種子均勻地撒播于培養(yǎng)基中。同時(shí)將授粉后120、194 d果莢內(nèi)種子分成4份，均勻撒播在4種培養(yǎng)基中，即Hyponex、KC[20]、1/2MS[21]（大量元素減半）、添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（BA 0.5 mg/L+NAA 2 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基。每個(gè)處理播種10瓶。以上所用培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、蛋白胨3 g/L、椰子汁10%及瓊脂6 g/L，并于高壓滅菌前將培養(yǎng)基中pH調(diào)至5.8。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光強(qiáng)為30～40 μmol/（m2·s），每天光照12 h。定期觀察并記錄種子萌發(fā)情況，以肉眼可見球狀體為啟始萌發(fā)，并于啟動(dòng)萌發(fā)后1個(gè)月統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5 for windows統(tǒng)計(jì)分析軟件包中的one-way ANOVA（LSD和Duncan檢驗(yàn)）軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交坐果情況

共授粉了145朵花，分3個(gè)區(qū)組進(jìn)行。結(jié)果表明，隨著授粉后時(shí)間的延長(zhǎng)，坐果率不斷下降，而落果率不斷上升。從總的雜交坐果與落果情況來看（表1），授粉后第150天尚存果莢90個(gè)，坐果率達(dá)62.1%；脫落果莢55個(gè)，落果率37.9%。至第259天時(shí)，尚存果莢80個(gè)，坐果率達(dá)55.2%；果莢成熟脫落或開裂，脫落果莢65個(gè)，落果率為44.8%。至第328天時(shí)，大部分果莢開裂，脫落果莢達(dá)130個(gè)，落果率達(dá)89.7%（表1）?！n國(guó)小姐ב企劍黑墨 結(jié)實(shí)掛果周期較長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)295 d，甚至更長(zhǎng)。從區(qū)組雜交坐果與落果情況來看，授粉后至第112天時(shí)，坐果率與落果率分別為65.9%與31.5%，與0、295、328 d的坐果率與落果率相比較差異顯著，但與150、259 d的坐果率與落果率相比較差異不顯著（表1）?？梢?，授粉后0～112 d落果較為嚴(yán)重。

2.2 果莢的生長(zhǎng)發(fā)育變化

果長(zhǎng)及果寬走勢(shì)大致相同。授粉后2～3 d可見柱頭膨大，萼瓣片開始失水皺縮或卷曲；10～12 d子房開始膨大。而后很長(zhǎng)一段時(shí)間，果莢不斷膨大，屬快速增長(zhǎng)期。直至授粉后160～180 d時(shí)，果莢膨大逐漸趨于平穩(wěn)，而后出現(xiàn)下降后上升再下降上升的波動(dòng)（圖1）。至授粉后180 d時(shí)，果莢大小基本趨于平穩(wěn)，果長(zhǎng)（7.17±0.03）cm，果寬（20.57±0.19）mm。成熟果莢呈棱形，近柱頭端稍鈍；果皮呈翠綠或翠綠并稍泛黃，果皮表面漸變粗糙，果棱皺縮。

2.3 果莢采收時(shí)期及培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響

不同采收時(shí)期（授粉后120、194、232 d）果莢性狀見表2。3個(gè)不同時(shí)期果莢中，以194 d果莢最大，果重為（5.46±0.18）g，果長(zhǎng)為（7.17±0.09）cm，果寬為（19.81±0.53）mm。雖然3個(gè)時(shí)期果莢色澤均翠綠，但232 d 果莢果棱明顯呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)。不同采收時(shí)期對(duì)種子萌發(fā)影響差異顯著。目前（播種后180 d）為止，未見120、232 d種子萌發(fā)；僅見194 d種子萌發(fā)，并在0.01水平達(dá)極顯著差異（表2）?？梢?，以授粉后194 d果莢采收進(jìn)行無菌播種較佳。

由表3可知，不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)影響差異顯著。在4種培養(yǎng)基中，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，萌發(fā)較快，最早萌發(fā)所需時(shí)間為132 d。而在Hyponex及KC培養(yǎng)基中萌發(fā)較晚，為163 d。在4種培養(yǎng)基中均可觀察到原球莖與根狀莖，且均健壯。但以1/2MS中培養(yǎng)萌發(fā)個(gè)數(shù)最多，平均達(dá)25.3個(gè)，在0.01水平達(dá)極顯著差異（表3）；且綠色原球莖迅速伸長(zhǎng)繼而形成多分支狀根狀莖，表面著生大量白色根毛狀物質(zhì)。而其他3種培養(yǎng)基中觀察到的根狀莖短且分支少或無分支，表面白色根毛狀物質(zhì)著生少（圖2）；另外，形成的根狀莖具有成苗快的優(yōu)點(diǎn)，具雜種優(yōu)勢(shì)。本研究中，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA 0.5 mg/L+NAA 2 mg/L）未能縮短啟動(dòng)萌發(fā)所需的時(shí)間，也未能提高萌發(fā)個(gè)數(shù)?？梢姡?種培養(yǎng)基中，‘韓國(guó)小姐ב企劍黑墨雜交種子在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)為佳。此外，本研究結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)較佳的培養(yǎng)基比萌發(fā)欠佳或無萌發(fā)的培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重。

3 討論與結(jié)論

張東旭[9]的研究結(jié)果顯示以大花蕙蘭和墨蘭的雜交后代為母本與大花蕙蘭進(jìn)行雜交，是提高雜交結(jié)果率且得到雜交后代的有效途徑。本研究中，利用大花蕙蘭和墨蘭的雜交種‘韓國(guó)小姐與墨蘭‘企劍黑墨進(jìn)行雜交，具較高的親和性，至授粉后第150天時(shí)，果莢坐果率達(dá)62.1%。結(jié)果證明了大花蕙蘭與墨蘭的雜交種為母本與墨蘭雜交能大幅度提高雜交坐果率，并且有利于雜交組合的獲得進(jìn)而改良蘭屬植物種質(zhì)。整個(gè)果莢生長(zhǎng)發(fā)育期間，授粉后0～112 d落果較為嚴(yán)重，可能由于無法完成雙受精或是胚敗育，具體成因還須結(jié)合胚胎學(xué)進(jìn)一步深入研究。此外，果莢生長(zhǎng)后期出現(xiàn)下降后上升的波動(dòng)，可能是由于果莢養(yǎng)分吸收變緩或是失水萎縮所致[2，4，7-11，22]。

蘭科植物種子成熟度及培養(yǎng)基是種子萌發(fā)的重要影響因子。通常種子過于幼嫩或成熟均不利萌發(fā)，且成熟種子無菌播種萌發(fā)比未成熟種子困難[15-16，19，23-24]。關(guān)于其內(nèi)在休眠機(jī)制尚不明確，但目前普遍認(rèn)為是成熟種子進(jìn)入休眠期，由于在其發(fā)育過程中不斷累積萌發(fā)抑制物質(zhì)，同時(shí)種胚抗?jié)B性增強(qiáng)，不利于養(yǎng)分吸收[9，15-16， 24-25]。但亦有研究認(rèn)為是由于內(nèi)珠被萎縮形成一層致密的膜狀物并包圍種胚，即‘殼（carapace），影響種胚水分及養(yǎng)分的吸收；殼中還可檢測(cè)到各種化學(xué)成分，諸如木質(zhì)素、纖維素、木栓質(zhì)及角質(zhì)層物質(zhì)等，增加種子的抗?jié)B性進(jìn)而影響種子萌發(fā)[17-19，24， 26]。本研究中，種子采收時(shí)期及培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)影響顯著，可見采收時(shí)期及培養(yǎng)基均為種子萌發(fā)的重要影響因子。授粉后194 d種子培養(yǎng)可萌發(fā)，而授粉后120、232 d種子培養(yǎng)未見萌發(fā)?？赡苡捎谑诜酆?20 d種子過于幼嫩而授粉后232 d種子已發(fā)育成熟進(jìn)入休眠期而難于萌發(fā)，但其具體的休眠機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

大花蕙蘭與墨蘭的雜種胚從具有萌發(fā)能力后一直保持著這種萌發(fā)能力，直至種子完全成熟時(shí)仍可正常萌發(fā)[8]。大花蕙蘭與墨蘭雜交，無論是正交還反交，其雜交種子均以原球莖方式萌發(fā)[2， 8， 27]。并認(rèn)為大花蕙蘭的原球莖再生性狀由顯性基因控制，而墨蘭的根狀莖再生方式由隱性基因控制[27]。本研究中，雜交種子至完全成熟時(shí)則無法萌發(fā)。種子萌發(fā)方式與大花蕙蘭與墨蘭雜種萌發(fā)方式不同，表現(xiàn)為原球莖而后根狀莖繼而快速成苗的過程，具雜種優(yōu)勢(shì)；雖經(jīng)根狀莖，但分化成苗容易且快，與傳統(tǒng)蘭屬地生性蘭如春蘭、建蘭及墨蘭等種子萌發(fā)形成的根狀莖難于成苗有區(qū)別?？赡苁怯捎诒狙芯恐须s交種子特性更傾向于墨蘭，更多地表現(xiàn)出地生蘭的特性，而大花蕙蘭×墨蘭雜交種子更多地傾向于大花蕙蘭。此種萌發(fā)方式與紋瓣蘭（C. aloifolium）、冬風(fēng)蘭（C. dayanum）種子萌發(fā)方式相類似[28-30]。此外，以建蘭（C. ensifolium）為母本與紋瓣蘭雜交、紋瓣蘭為母本與銀邊墨蘭（C. sinense ‘Yinbian Molan）雜交及雜交蘭 ‘韓國(guó)桃花 （大花蕙蘭×墨蘭）為母本與蕙蘭（C. faberi）雜交的種子也以此方式萌發(fā)[2，6，31]。Yamazaki等[24]在金蘭（Cephalanthera falcata）種子非共生的萌發(fā)研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在褐化的培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率最高。本研究中亦發(fā)現(xiàn)相類似的現(xiàn)象，即在褐化較嚴(yán)重的培養(yǎng)基中種子萌發(fā)較佳，而在微褐化或無褐化的培養(yǎng)基中種子萌發(fā)欠佳或無萌發(fā)。這可能歸因于種子萌發(fā)過程中釋放出致培養(yǎng)基褐化的物質(zhì)，但這種致褐化物質(zhì)與種子萌發(fā)的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。

致謝 感謝福建省亞熱帶植物研究所張慶美副研究員對(duì)本研究提供的幫助！

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