劉汝寬， 陳金良， 肖志紅， 李昌珠

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中南大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 湖南 長沙 410083；3.湖南省生物柴油工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004)

菌種發(fā)酵歧化甘油產(chǎn)1,3-PDO條件研究*

劉汝寬1, 2*， 陳金良1, 3， 肖志紅1, 3， 李昌珠1, 3

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中南大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 湖南 長沙 410083；3.湖南省生物柴油工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004)

以甘油為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)對菌株間歇發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的生產(chǎn)條件進(jìn)行了研究.結(jié)果表明：最適的甘油含量為40 g/L，最適氮源為(NH4)2HPO4，用量為3 g/L，pH 7.5，溫度為30 ℃，裝液量為40%，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，發(fā)酵時(shí)間為24 h.在最佳培養(yǎng)基組成與最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵了3批，最終的1,3-PDO濃度平均值為23.2 g/L，甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率為70.2%，比優(yōu)化前的60.5%提高了9.7%.

1,3-丙二醇；發(fā)酵；優(yōu)化；甘油

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一種重要的化工原料，可用于防凍劑，也是多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料.但最主要的用途是作為單體與對二甲酸合成新型聚酯材料——聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)，它具有良好的回彈性、易染性、抗污性、耐磨性、低吸水性及生物可降解性.隨著全球?qū)TT需求量的日益增高，對關(guān)鍵原料1,3-丙二醇的需求量也逐漸加大.

目前，1,3-丙二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)方法和微生物發(fā)酵法.大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是化學(xué)合成法，國際市場主要由殼牌(Shell)和杜邦(Du Pont)公司壟斷，但從其生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展趨勢來看，正在由相對成熟的化學(xué)合成法向微生物發(fā)酵法過渡[1～5].其主要原因是：化學(xué)方法資源不可再生，且環(huán)境污染嚴(yán)重，使其長久發(fā)展受到限制；而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇具有原材料來源廣泛、環(huán)境污染小、資源可再生等優(yōu)點(diǎn)，并能適應(yīng)可持續(xù)發(fā)展的需要[6].

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇關(guān)鍵是菌種及發(fā)酵條件，本實(shí)驗(yàn)以優(yōu)選的克雷伯氏肺炎桿菌2e為發(fā)酵菌種，對培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過對甘油濃度、氮源種類及用量、發(fā)酵的PH值、溫度、轉(zhuǎn)速等單因素試驗(yàn)，優(yōu)化了培養(yǎng)基配比及發(fā)酵工藝條件.

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種是本實(shí)驗(yàn)室分離出的克雷伯氏肺炎桿菌2e，所用培養(yǎng)基組成見參考文獻(xiàn)[7].所用儀器有HZS-HA水浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)，1 mL移液槍(Eppendorf)，常見玻璃儀器，GC-2014氣相色譜儀(島津).

1.2 分析方法

1.2.1 生物量分析 采用比濁法測定波長650 nm下細(xì)胞的光密度(OD650)[8].細(xì)胞干重測量：取10 mL發(fā)酵液離心(10 000 r/min)15 min后用去離子水洗滌2次，在80 ℃下干燥至恒重.

1.2.2 測定1,3-PDO的含量 采用氣相色譜法測定1,3-PDO的含量，選取1,6-己二醇作為內(nèi)標(biāo)物，色譜柱長30 m,柱直徑0.25 mm,液膜厚度0.25 μL，進(jìn)樣室250 ℃,檢測器240 ℃；程序升溫：110 ℃,4 min，5 ℃/min升溫到120 ℃，再以30 ℃/min升溫190 ℃,1.7 min；載氣線速度12 mL/min，進(jìn)樣量0.4 μL.

1.2.3 甘油含量的測定 甘油剩余量分析參考文獻(xiàn)[9].計(jì)算公式如下：

式中： 92.1 為甘油分子量；C為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度(mol/L)；V為滴定過程中消耗掉的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積(mL)；n為吸取的發(fā)酵液量(mL).

2 結(jié)果與討論

2.1 甘油用量影響

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分和濃度不變，改變培養(yǎng)基的甘油用量為10、20、30、40、50、60、70、80、90 g/L，接種，pH 7.2；于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量，結(jié)果見圖1.

由圖1可知，隨著甘油濃度的增大甘油的剩余量迅速增大，而1,3-PDO產(chǎn)量則是先上升后下降，甘油為40 g/L時(shí)1,3-PDO產(chǎn)量最大，并且甘油的剩余量也很低，這時(shí)甘油的利用率達(dá)到了最大值.低濃度時(shí)細(xì)菌生長比較好，但甘油主要用來提供細(xì)菌生長，而沒有轉(zhuǎn)化成1,3-PDO；而高濃度的甘油抑制了細(xì)菌的生長，故1,3-PDO產(chǎn)量很低.因此選擇40 g/L甘油作為最佳初始甘油濃度.

2.2 氮源種類的影響

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分和濃度不變，選取甘油含量為40 g/L，改變培養(yǎng)基的氮源的種類為(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4、NH4NO3、蛋白胨和酵母膏，含量均為2 g/L，接種，pH 7.2；于30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量結(jié)果見圖2.

由圖2可知，不同種類的氮源對2e菌的生長量和1,3-PDO產(chǎn)量的影響很大，其中以NH4NO3為氮源時(shí)，菌株的生長量最小，1,3-PDO產(chǎn)量幾乎為零；以(NH4)2HPO4為氮源時(shí)，菌株的生長量和1,3-PDO產(chǎn)量均達(dá)到最大，甘油的剩余量也達(dá)到最小值.因此選擇(NH4)2HPO4為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)研究.

2.3 (NH4)2HPO4用量的影響

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分和濃度不變，選取甘油含量為40 g/L，(NH4)2HPO4用量為1、2、3、4 g/L.接種，pH 7.2；于30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量結(jié)果見圖3.

由圖3可知，加入(NH4)2HPO4后，菌體生長很迅速，培養(yǎng)24 h后OD650值都在2.1以上；隨著量的增加，1,3-PDO的產(chǎn)量經(jīng)歷了先增加后減少，3 g/L時(shí)達(dá)到最大值.由甘油的剩余量曲線圖可知，它與1,3-PDO產(chǎn)量曲線圖正好成互補(bǔ)狀態(tài).即1,3-PDO產(chǎn)量高的，甘油消耗就多；反之甘油剩余量就多.

2.4 發(fā)酵條件

2.4.1 pH值的影響 保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分和濃度不變，選取甘油含量為40 g/L，(NH4)2HPO4用量3 g/L，依次改變發(fā)酵液的初始pH 為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5.接種后于30 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量,結(jié)果見圖4.

由OD650值曲線可知弱酸性條件不利于2e菌的生長，并且此菌利用甘油產(chǎn)丙二醇的能力比較低；而中性或弱堿性條件則是此菌的有利生長環(huán)境，1,3-PDO的產(chǎn)量較高，在pH為7.5時(shí)OD值達(dá)到峰值，此時(shí)1,3-PDO產(chǎn)量也最高，甘油剩余量較少.因此選擇7.5為最佳pH值條件進(jìn)行后續(xù)工作的研究.

2.4.2 溫度的影響 溫度既能影響反應(yīng)速率和發(fā)酵液的物理性質(zhì)，也能改變代謝產(chǎn)物的合成方向，是發(fā)酵培養(yǎng)的重要條件.保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分和濃度不變，選取甘油含量為40 g/L，(NH4)2HPO4用量3 g/L，依次改變發(fā)酵液的初始pH接種后于150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量，結(jié)果見圖5.

由圖5可知，溫度由24 ℃升溫到26 ℃時(shí)，菌的生長量和1,3-PDO產(chǎn)量都有明顯升高的趨勢，再升溫到30 ℃，二者的變化速率降低，但是仍然在升高，30 ℃都達(dá)到最大值，溫度再升高，兩者迅速降低，這表明溫度對細(xì)菌的生長和1,3-PDO產(chǎn)量有比較大的影響，高溫不利于菌生長產(chǎn)1,3-PDO.從甘油剩余量曲線可以看出，在26 ℃以下32 ℃以上甘油剩余量都很大，32 ℃時(shí)剩余量最小，此溫度下甘油的利用率最大.綜合考慮，選擇30 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度進(jìn)行后續(xù)的研究工作.

2.4.3 通氣量的影響 通氣量是考察細(xì)菌對氧的需求情況，雖已鑒定是兼氧性細(xì)菌，但仍需進(jìn)一步探討.因此在上述優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，選擇100 mL的三角瓶，分別裝入20、30、40、50、60、70 mL發(fā)酵液，密封后于150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量,結(jié)果見圖6.

該菌在好氧條件下(裝液量少)生長得比較快，但是丙二醇的產(chǎn)量不高.此時(shí)的甘油利用率比較高，原因可能是好氧條件下菌生長旺盛，消耗的甘油主要用來繁殖而沒有產(chǎn)1,3-PDO.在通氣量小的條件下生長緩慢，產(chǎn)丙二醇的效率也很低，原因是沒有足夠多的菌來工作產(chǎn)1,3-PDO.由圖6可以看出在100 mL的三角瓶中裝入發(fā)酵液40 mL條件下甘油的利用率最高，丙二醇的產(chǎn)量最大，因此選擇裝液量為40%為最佳通氣量.

2.4.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響 利用前面的優(yōu)化結(jié)果，選擇搖床轉(zhuǎn)速分別為50、75、100、125、150、175、200 r/min考察轉(zhuǎn)速對菌體生長情況、甘油剩余量及1,3-PDO生成量的影響，結(jié)果如圖7所示.

由圖7可以看出，50 r/min菌體沒有充分生長，1,3-PDO產(chǎn)量也很低，原因菌體生長只能在局部消耗營養(yǎng)物質(zhì)，轉(zhuǎn)速達(dá)到100 r/min，菌體生長量和產(chǎn)量都迅速增加而基本達(dá)到最大值，此時(shí)甘油剩余量也比較小.再增加轉(zhuǎn)速，1,3-PDO產(chǎn)量基本不再提高，甘油剩余量也沒有太大的變化.因此從節(jié)能和1,3-PDO產(chǎn)量兩方面綜合考慮，選擇100 r/min作為最佳轉(zhuǎn)速進(jìn)行后續(xù)的研究工作.

2.5 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間的長短關(guān)系到菌種發(fā)酵1,3-PDO的效率，時(shí)間越短，效率越高，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)1,3-PDO的量就大，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn).選擇12、24、36、48、60、72、84、96 h進(jìn)行發(fā)酵，其結(jié)果見圖8.

由圖8可以看出，培養(yǎng)12 h菌體沒能充分生長，12～24 h菌迅速生長，24 h以后生長量不再升高，隨著時(shí)間的延長反而有下降的趨勢，原因可能是發(fā)酵液中的甘油含量有限，到發(fā)酵后期不能提供足夠的營養(yǎng).發(fā)酵24 h后1,3-PDO產(chǎn)量基本上達(dá)到了最大值，延長時(shí)間其產(chǎn)量并沒有增加太多，但是甘油的剩余量有所下降，原因是菌體代謝消耗甘油.因此，發(fā)酵時(shí)間選擇24 h為宜，這樣既能提高1,3-PDO產(chǎn)量，又能提高生產(chǎn)效率.

3 結(jié) 論

通過對菌體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基組成、最優(yōu)發(fā)酵條件以及最佳發(fā)酵時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)的研究，得到了最適的甘油含量為40 g/L，最適氮源為(NH4)2HPO4，用量為3 g/L；通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為pH 7.5,溫度為30 ℃,裝液量為40%,100 r/min,最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h.在最佳培養(yǎng)基組成與最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵菌種3批，最終的1,3-PDO濃度平均值為23.2 g/L，甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率為70.2%，比優(yōu)化前的60.5%提高了9.7%.

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責(zé)任編輯：朱美香

Conditions of Disproportionation Fermentation of Glycerol for 1,3-Propanediol by Bacteria

LIURu-kuan1,2*,CHENJin-liang1,3,XIAOZhi-hong1,3,LIChang-zhu1,3

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004;2.College of Chemistry & Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083;3.Hunan Engineering Center for Biodiesel, Changsha 410004, China)

Through single-factor test, conditions of disproportionation fermentation by glycerol for 1,3-propanediol (PDO) by bacteria were optimized. The results show that the optimal glycerol content is 40 g/L, the optimum nitrogen source is (NH4)2HPO4with dosage of 3 g/L, pH of 7.5, temperature of 30 ℃, liquid volume of 40%, shaking speed of 100 r/min, and fermentation time of 24 h. In the optimal medium and fermentation conditions, three batches of experiments were carried out and the average concentration of 1,3-PDO could reach 23.2 g/L, which raised the molar yield of glycerol from 60.5% to 70.2%.

1, 3-propanediol; fermentation; disproportionation reaction; glycerol

2014-07-16

國家林業(yè)局公益項(xiàng)目(201304608)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013NK3059)

劉汝寬(1981— ),男，山東 騰州人，副研究員.E-mail:liurukuan@gmail.com

TQ923

A

1000-5900(2015)01-0062-05