程振玉，宋海燕，楊英杰*，姜冠澤，于世華，薛俊禮

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132101）

0 引言

龍膽草（Gentiana scabra Bge.），又名龍膽、草龍膽、地膽草，基源為龍膽科龍膽屬植物龍膽（Gentiana scabra Bge.）、條葉龍膽（Gentiana manshurica Kitag.）、三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）和滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根和莖[1].龍膽草主要分布于吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、廣東、廣西、新疆、安徽等地[1-2].龍膽苦苷是龍膽草最有效的成分[3]，在治療肝損傷、肺損傷、心肌損傷等方面有顯著的藥理作用，且具有健胃、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛等重要作用[4].

李超等[3]、趙瑞芝等[5]均采用傳統(tǒng)技術(shù)熱回流法從龍膽草中提取了龍膽苦苷，但提取工藝明顯存在提取時間長，且提取溫度高等不足之處.在龍膽苦苷含量測定方面，目前大多數(shù)報(bào)道均采用高效液相色譜法（HPLC），但其主要集中在中藥制劑領(lǐng)域中的應(yīng)用，而在中藥材龍膽草的應(yīng)用方面相對較少，尤其在分析和評價不同產(chǎn)地的龍膽草質(zhì)量方面略顯不足.高瑞斌等[6]建立了高效毛細(xì)管電泳測定川西獐芽菜中龍膽苦苷的方法；劉智等[7]、謝瑞萍[8]、路長榮等[9]和段吉平等[10]均采用HPLC 法，分別測定了肝舒膠囊、復(fù)方龍膽片、胃痛寧等藥中龍膽苦苷的含量；常艷琴等[11]采用HPLC 法，分析了龍膽草中龍膽苦苷的含量.HPLC 法分析速度快，靈敏度高，操作簡單，分析含量準(zhǔn)確、可靠，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然藥物活性成分的分析[12-14].超聲波提取技術(shù)具有節(jié)省溶劑、提取時間短、操作簡單且提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[15-16].因此，筆者首先建立了HPLC分析中藥材中龍膽苦苷的方法，然后用正交試驗(yàn)對超聲波輔助萃取龍膽苦苷的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，且對不同產(chǎn)地龍膽草中龍膽苦苷的含量進(jìn)行了分析.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍膽草共產(chǎn)自6 個地區(qū)，由吉林化工學(xué)院隋新副教授基于植物形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行鑒定.

對照品龍膽苦苷（生產(chǎn)批號：MUST-14052205）：四川成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 儀器與設(shè)備

P230 型高效液相色譜儀（配備UV-230 紫外檢測器）：大連依利特公司；FA1004 型電子天平：上海舜宇恒科儀器有限公司；SY-800 超聲波清洗器：上海寧商超生儀器有限公司；RT-08 型多功能粉粹機(jī)：榮聰精密科技有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D 型循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），進(jìn)樣量20 μL，流量1.0 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫25 ℃；流動相A 為乙腈，B 為0.4%的甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～ 10 min，A 從5%上升到28%；10～16 min，A 從28%上升到30 %；16～16.1 min，A 從30%增加到100%，保持14 min；30～ 30.1 min，A 從100%降低到5%，保持15 min.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取置于干燥器中48 h 以上的龍膽苦苷對照品，準(zhǔn)確稱量11.40 mg，加適量甲醇溶解、搖勻，定容到25 mL 容量瓶中，得到456.0 μg/mL 的龍膽苦苷對照品儲備液.取一定量對照品儲備液，采用連續(xù)稀釋的方法，得到質(zhì)量濃度依次為456.0、342.0、228.0、114.0、57.0、28.5、9.12 μg/mL 的7 個水平的溶液.按照“1.3.1”的色譜條件進(jìn)行分析.以龍膽苦苷峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，

1.3.3 龍膽苦苷的提取與含量分析

將干燥的龍膽草粉碎，過篩（120 目）后，精確稱量1.0 g，放置于150 mL 平底燒瓶中，加入一定量的提取劑，然后將其浸沒于盛有水的超聲波清洗器中，以特定功率于一定溫度下提取一段時間.提取結(jié)束后，抽濾，收集濾液；燒瓶及藥渣用少量80%乙醇洗滌數(shù)次后繼續(xù)抽濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，最后添加少量提取劑定容，搖勻.用移液管精確量取5 mL，加80%乙醇定容到25 mL，取少量試液過0.45 μm 微孔濾膜，供HPLC檢測，按下列公式計(jì)算龍膽苦苷含量.

1.3.4 超聲波輔助萃取龍膽苦苷的正交優(yōu)化L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]

在考察單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）表，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對提取溫度、提取時間、超聲波功率和料液比4 個因素進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表1.

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

取“1.3.2”的對照品儲備液適量，采用紫外光譜掃描，結(jié)果顯示270 nm 左右處有最大吸收波長.因此，本試驗(yàn)以270 nm 作為檢測波長.

試驗(yàn)分別考察了甲醇-水（V/V=10∶90）、乙腈-水（V/V=10∶90）、甲醇-乙腈-水（V/V/V=5∶5∶90）以及乙腈-0.4%甲酸溶液4 種流動相體系下，龍膽苦苷的對照品及其供試品的色譜分離情況.結(jié)果表明：采用甲醇-水做流動相體系，龍膽苦苷出峰時間晚，且峰展開很寬；在乙腈-水、甲醇-乙腈-水兩種流動相體系下，分析時間均明顯縮短，但可能由于苷類化合物的本身水解產(chǎn)生干擾物質(zhì)等原因，龍膽苦苷峰形上半部尖銳對稱，下半部分卻展開較寬，甚至呈現(xiàn)前伸峰的趨勢；采用乙腈-0.4%甲酸水溶液做流動相體系，水解得到了抑制，分析時間縮短，且峰形尖銳，對稱度好，龍膽苦苷得到了良好的洗脫和分離，對照品溶液和供試品溶液色譜圖分別見圖1A 和圖1B.為了滿足目標(biāo)成分良好的分離度和洗脫效果，并且減少拖尾和包峰等現(xiàn)象，研究選擇乙腈-0.4%甲酸溶液為流動相體系.

2.2 超聲波輔助提取龍膽苦苷工藝條件的優(yōu)化

試驗(yàn)首先考察了提取溶劑（20%、40%、60%、80%、100%乙醇和甲醇）對超聲波輔助萃取龍膽苦苷提取率的影響.結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)低于80%時，隨著體積分?jǐn)?shù)的提高，龍膽苦苷提取率逐漸上升，但體積分?jǐn)?shù)高于80%時，進(jìn)一步增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，其提取率不再有明顯變化；采用甲醇作溶劑，提取率略高于乙醇.綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)的安全性和經(jīng)濟(jì)效益，試驗(yàn)選擇80%乙醇作最佳提取劑.超聲波功率、提取溫度、超聲時間和料液比的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2.

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

表2 超聲波輔助萃取龍膽苦苷正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments L9(34) of ultrasound-assisted extraction

由表2 可知，在超聲波輔助萃取龍膽苦苷的工藝中，所考察因素的影響主次順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C，即超聲波功率＞提取溫度＞提取時間＞料液比；因素間的最佳組合為A2B2C3D3；因此試驗(yàn)確定提取條件為：提取溫度35 ℃，提取時間45 min，料液比1∶30，超聲波功率250 W，最佳提取劑為80%的乙醇，在此條件下，龍膽草中龍膽苦苷的提取率為5.11%.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和檢出限、定量限

以龍膽苦苷峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=15.451 X +117.62，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明在9.12～456.0 μg/mL 范圍內(nèi)龍膽苦苷含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系.對質(zhì)量濃度最低的溶液逐級進(jìn)行稀釋，以信噪比（S/N）約為3 計(jì)檢出限（LOD），S/N 約為10 計(jì)定量限（LOQ），其結(jié)果分別為0.033 6 μg/mL、0.106 6 μg/mL，表明該法靈敏度高，可用于龍膽苦苷的準(zhǔn)確分析.

2.4 精密度試驗(yàn)

吸取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，龍膽苦苷測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.35%，說明儀器的精密度良好.

2.5 重現(xiàn)性考察

稱取干燥龍膽草（120 目）6 份，每份1.0 g，在試驗(yàn)所優(yōu)化的最佳工藝條件下進(jìn)行提取，按照“1.3.1”的色譜條件，用HPLC 分析含量，龍膽苦苷測定的RSD 為1.58%.表明該方法重現(xiàn)性良好.

2.6 穩(wěn)定性分析

精密稱取干燥龍膽草（120 目）1.0 g，在試驗(yàn)所優(yōu)化的最佳工藝條件下進(jìn)行提取，提取液室溫放置5 d，分別在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 測定，龍膽苦苷測定值的RSD 為3.35%.表明在該試驗(yàn)條件下，供試品溶液5 d 內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取一定量龍膽苦苷對照品儲備液，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)稀釋成一定濃度的高、中、低3 個水平的溶液.精確稱量已知龍膽苦苷含量的龍膽草（120 目）6份，每份0.5 g，分別加入一定量的上述對照品溶液，按照試驗(yàn)所確定最佳工藝條件制備樣品溶液，用HPLC 法分析含量，結(jié)果見表3.

2.8 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地的干燥龍膽草樣品（120 目）1.0 g，按照優(yōu)化的超聲波輔助提取條件和“1.3.1”所述色譜條件，對龍膽苦苷提取并進(jìn)行含量分析，結(jié)果見表4.

3 結(jié)論

本研究首先對高效液相色譜法的分析條件進(jìn)行了討論，建立了定量分析龍膽苦苷含量的HPLC法，然后基于該法，用正交試驗(yàn)對超聲波輔助萃取龍膽苦苷的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，定量優(yōu)化了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法-超聲波輔助法萃取龍膽苦苷的工藝條件.超聲波最佳提取工藝條件為：提取溫度35℃，提取時間45 min，料液比1∶30，超聲波功率250 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%；該技術(shù)具有提取時間短、溫度低等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法.本文建立的HPLC 法，以乙腈-0.4%甲酸溶液作流動相，分析時間短，龍膽苦苷得到了良好的洗脫和分離，且峰形尖銳，對稱度高，與干擾物質(zhì)完全分離.試驗(yàn)表明HPLC 法精密度高，重現(xiàn)性好，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為評價龍膽草活性成分龍膽苦苷提供了一種可靠的分析方法；同時，本研究對不同產(chǎn)地的龍膽苦苷同時進(jìn)行提取，做了對比研究，為進(jìn)一步研究龍膽草的藥理活性和質(zhì)量控制提供了基礎(chǔ)化學(xué)數(shù)據(jù)支撐.

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of recoveries tests（n=6）

表4 樣品含量分析結(jié)果Table 4 Analytical results of samples

［1］侴桂新，王崢濤，董婷霞，等.龍膽藥材中龍膽苦苷的含量測定［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（11）:53-55.

［2］吉惠杰，楊英杰，楊艷俊，等.龍膽苦苷分離方法研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，133（12）:133-134.

［3］李超，韓泳平.響應(yīng)面優(yōu)化龍膽草中龍膽苦苷提取工藝的研究［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，39（2）:204-208.

［4］郭清峰，王瑋，韓文清.龍膽苦苷的藥理作用進(jìn)展［J］.廣東化工，2014，41（17）:121.

［5］趙瑞芝，梁偉杰，丘小惠.龍膽藥材中龍膽苦苷的提取工藝研究［J］.中國藥房，2005，16（12）:956-957.

［6］高瑞斌，董樹清，楊艷，等.高效毛細(xì)管電泳同時測定川西獐芽菜中龍膽苦苷和獐芽菜苦苷［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（5）:994-997.

［7］劉智，余綺，黃武軍，等.肝舒膠囊中龍膽苦苷含量測定的研究［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，14（1）:44-45.

［8］謝瑞萍.HPLC 法測定復(fù)方龍膽片中龍膽苦苷的含量［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32（7）:74-75.

［9］路長榮，王衛(wèi)峰.HPLC 法測定胃痛寧片中龍膽苦苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（7）:891-892.

［10］段吉平，馮麗，張立濤.高效液相色譜法測定當(dāng)藥中龍膽苦苷含量的方法［J］.中國藥業(yè)，2013，22（4）:39-40.

［11］常艷琴，王德.HPLC 法測定龍膽草中龍膽苦苷含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2011，24（4）:533-534.

［12］程振玉，楊英杰，劉治剛，等.高效液相色譜法測定北五味子中5 種木脂素含量［J］.理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊），2014，50（5）:575-578.

［13］賈蔓箐，唐輝，李翠華，等.棉油皂腳中植物甾醇的提取工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（6）:45-48.

［14］楊立芳，劉洪存，姜明國，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)選毛果魚藤中香豆素類成分提取工藝的研究［J］.藥物分析雜志，2015，35（3）:506-511.

［15］張悅怡，劉勇慧，趙巖，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取五味子木脂素工藝研究［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5（6）:1855-1861.

［16］Cheng Z Y，Yang Y J，Liu Y，et al.Twosteps extraction of essential oil，polysacchar -ides and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Baill fruits［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Anaysis，2014，96：162-169.

［17］王秀娟，馬艷梅，商雪嬌，等.五味子多糖不同提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（12）:289-291.