張會(huì)娜，呂建華，張晨光，白旭光

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

與傳統(tǒng)化學(xué)方法防治儲(chǔ)藏物害蟲相比，熱處理殺蟲因其無污染、操作簡(jiǎn)單、殺蟲迅速、不破壞環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，可以較好地滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，在糧食儲(chǔ)藏空倉處理和加工場(chǎng)所殺蟲實(shí)踐中得到廣泛的認(rèn)可[1].國(guó)內(nèi)外就熱處理防治儲(chǔ)藏物害蟲的技術(shù)原理、殺蟲效果和應(yīng)用技術(shù)等已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究[2-5].美國(guó)食品藥品管理局（FDA）已于2008 年批準(zhǔn)在糧食和食品行業(yè)采用熱處理防治害蟲，肯定了高溫殺蟲的潛在價(jià)值[4].熱處理殺蟲已在北美、歐洲、澳大利亞得到廣泛應(yīng)用.

高溫影響昆蟲新陳代謝，導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量、酶活性等發(fā)生一系列變化[6].其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）是比較重要的3 種保護(hù)酶，能保護(hù)生物體不受自由基的損害，F(xiàn)ridovich 稱這3 種酶為保護(hù)酶系統(tǒng)[7].昆蟲的耐熱性與保護(hù)酶系統(tǒng)有關(guān).因此，可將昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性變化作為熱處理?xiàng)l件選擇的重要指標(biāo).

馴化（Acclimation）指生物在亞致死高溫或低溫范圍內(nèi)長(zhǎng)時(shí)期（數(shù)天或數(shù)周，甚至整個(gè)世代）暴露，并獲得增強(qiáng)的耐熱性或耐寒性，同時(shí)導(dǎo)致生物體發(fā)生可逆和不可逆的生理變化過程.短時(shí)鍛煉（Hardening）是相對(duì)于馴化而言的一種亞致死高溫或低溫短時(shí)間（數(shù)小時(shí)甚至數(shù)分鐘）馴化.生物處于亞致死高溫環(huán)境中一定時(shí)間，其自身的耐熱性會(huì)發(fā)生變化.隨著全球氣候變暖，昆蟲對(duì)高溫的適應(yīng)能力也有一定的變化.Krebs 和Loeschcke 發(fā)現(xiàn)將一種果蠅（Drosophila buzzatii）的蛹放在38 ℃環(huán)境中1 h，其成蟲的耐熱性顯著提高[8].作者前期研究結(jié)果（待發(fā)表）也表明，經(jīng)過短時(shí)的亞致死高溫鍛煉后，玉米象對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)能力顯著增強(qiáng)，但短時(shí)高溫鍛煉后的昆蟲經(jīng)過一定時(shí)間的熱處理后，其體內(nèi)3 種保護(hù)酶SOD、POD、CAT 活性的變化情況還未知.本試驗(yàn)以玉米象為對(duì)象，研究熱處理對(duì)經(jīng)歷過短時(shí)高溫鍛煉的玉米象成蟲的影響，以明確對(duì)高溫和亞致死高溫有一定適應(yīng)能力的玉米象，經(jīng)過熱處理后體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化情況，以期在全球平均氣溫升高、生態(tài)環(huán)境改變的情況下，為熱處理殺蟲提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為河南工業(yè)大學(xué)儲(chǔ)藏物昆蟲實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)數(shù)代的玉米象，在（28±2）℃、RH（75±5）%的實(shí)驗(yàn)室條件下以干凈小麥飼養(yǎng)，取羽化后1～2 周的成蟲供試.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高溫鍛煉方法

挑選羽化1～2 周的玉米象成蟲（不分雌雄）若干頭置于空玻璃瓶中（直徑8 cm，高15 cm），在36℃、RH（75±5）%環(huán)境中鍛煉5 h，取出后在10 min內(nèi)進(jìn)行熱處理試驗(yàn).

1.2.2 熱處理方法

將玻璃瓶（直徑4 cm，高9.5 cm）置于恒溫水浴鍋中（保證水浸沒瓶身高度8 cm 左右），將溫濕度計(jì)探頭置于玻璃瓶中心以測(cè)瓶?jī)?nèi)溫度，待達(dá)到設(shè)定溫度并穩(wěn)定后快速接入20 頭羽化后1～2 周的玉米象成蟲，用脫脂棉封口減少瓶?jī)?nèi)溫濕度與外界的傳遞.熱處理?xiàng)l件設(shè)定為：43 ℃處理時(shí)間分別 為165、205、245、285、325、365、405、445 min；47℃處理時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80 min；51 ℃處理時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 min；55 ℃處理時(shí)間分別為40、50、60、70、80、90、100、110 s.將在不同處理溫度下處理不同時(shí)間后的試蟲取出，并在液氮中研磨制備酶液，重復(fù)3 次.以正常生存環(huán)境中的玉米象為對(duì)照.

1.3 酶活性測(cè)定

1.3.1 酶液的制備

參照李周直等[9]的方法并加以改進(jìn).取經(jīng)過高溫處理的玉米象成蟲20 頭，用pH 7.2 的Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）清洗干凈，液氮研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入2.0 mL預(yù)冷的離心管中，用Tris-HCl 緩沖液沖洗研缽后并入研磨液中，用緩沖液補(bǔ)充至2.0 mL，于0～4 ℃以11 000 r/min 離心20 min，取上清液作為提取酶液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中.

1.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照Bradford 的考馬斯亮藍(lán)G-250 方法測(cè)定上述酶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）[10].

1.3.3 酶活性測(cè)定

SOD 活性的測(cè)定參考馬志卿等[11]的鄰苯三酚法.總反應(yīng)體系為2.2 mL H2O、25 μL 鄰苯三酚、2.25 mL pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液（含1% 聚乙烯吡咯烷酮和1% EDTA），50 μL 酶液，于波長(zhǎng)為420 nm測(cè)定吸光度值.

SOD 活力（OD420·mg-1）=（OD1-OD2）/（OD1×0.5×蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度），

式中：OD1為鄰苯三酚2 min 吸光度；OD2為樣品吸光度.一個(gè)酶活單位相當(dāng)于4.525 mL 反應(yīng)液達(dá)到50%的抑制所需的酶量，酶活性以比活力表示.

POD 活性的測(cè)定參考Simon 等[12]的愈創(chuàng)木酚法.反應(yīng)混合液為2.0 mL pH 4.0 的醋酸緩沖液、50 μL 酶液、1.0 mL 0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚、1.0 mL 0.3 mol/L 的H2O2，加入試管立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm 波長(zhǎng)下比色，以蒸餾水調(diào)零，以緩沖液代替酶液作對(duì)照，記錄4 min 后的吸光度值.以每分鐘吸光度改變1 為一個(gè)酶活單位（U），酶活性以比活力表示.

POD 活力（U/mg）=OD1/t×蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，式中：OD1為混合液470 nm 的吸光度，t 為反應(yīng)時(shí)間（min）.

CAT 活性的測(cè)定參考楊蘭芳等[13]的標(biāo)準(zhǔn)曲線法.取A、B 兩支試管，A 為對(duì)照管，B 為樣品管.在A中按順序加入1.5 mL pH 7.8 的Tris-HCl 緩沖溶液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）、0.1 mL 酶液、1.4 mL H2O、1.0 mL 8% H2SO4.B 管里依次加1.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液、0.1 mL 酶液、1.1 mL H2O，0.3 mL 0.3 mol/L 的H2O2，搖勻，反應(yīng)3 min 后加入1.0 mL 8% H2SO4終止反應(yīng).用A 管調(diào)零，在波長(zhǎng)為240 nm 處測(cè)定樣品管的吸光度.酶活性以比活力表示.

CAT 活力（mg·min·mg-1）=，式中：A2為對(duì)照的吸光度；A1為樣品的吸光度；t 為反應(yīng)時(shí)間（min）；a、b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的常數(shù).

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)所取得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可信度以及各處理間的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 43 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象酶活性的影響

將在36 ℃環(huán)境中鍛煉5 h 的玉米象成蟲置于43 ℃的高溫條件下處理不同時(shí)間，測(cè)定其SOD、POD、CAT 活性，結(jié)果見表1.

由表1 可知，在整個(gè)熱處理時(shí)間段，試蟲體內(nèi)的SOD 活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，POD 活性先降低后升高，CAT 活性則先升高后降低再升高.熱處理后的玉米象體內(nèi)SOD 活性較對(duì)照組有明顯不同，在處理時(shí)間為245 min 時(shí)達(dá)到最大，是對(duì)照組的1.64 倍，之后逐步降低.POD 和CAT 在整個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)活性最低值都出現(xiàn)在熱處理時(shí)間為365 min 時(shí).

表1 43 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象保護(hù)酶活性影響Table 1 The effect of heat treatment at 43 ℃on protective enzyme specific activities in S.zeamais with high temperature hardening

2.2 47 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象酶活性的影響（表2）

表2 47 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象保護(hù)酶活性的影響Table 2 The effect of heat treatment at 47 ℃on protective enzyme specific activities in S.zeamais with high temperature hardening

由表2 可知，以47 ℃的高溫處理玉米象成蟲時(shí)，隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲體內(nèi)SOD 活性在0～40 min 時(shí)無顯著變化，40 min 以后逐漸降低；POD活性整體變化不大，CAT 活性先下降后升高.整個(gè)處理過程中SOD 活性有被抑制的現(xiàn)象，除處理時(shí)間為20 min 時(shí)其活性高于對(duì)照組外，其他時(shí)間段都低于對(duì)照組，且在處理時(shí)間為80 min 時(shí)酶活性僅為對(duì)照組的47%，二者差異顯著（P＜0.05）.熱處理時(shí)間為50 min 時(shí)，POD 活性被抑制，其活性顯著低于對(duì)照組.CAT 活性在熱處理時(shí)間為40 min 時(shí)達(dá)到最低，與其他處理時(shí)間差異顯著（P＜0.05）.

2.3 51 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象酶活性的影響（表3）

表3 51 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象保護(hù)酶活性的影響Table 3 The effect of heat treatment at 51 ℃on protective enzyme specific activities in S.zeamais with high temperature hardening

由表3 可見，在熱處理時(shí)間段內(nèi)，SOD 和POD活性整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，CAT 活性整體升高.玉米象體內(nèi)SOD 和POD 活性在整個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)均高于對(duì)照組，且在處理時(shí)間不大于3 min 時(shí)，SOD 活性無顯著差異（P＞0.05）.51 ℃熱處理對(duì)玉米象體內(nèi)CAT 活性的影響較大，表現(xiàn)為除3.5 min 處理外，其他處理時(shí)間段CAT 活性顯著高于對(duì)照組.

2.4 55 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象酶活性的影響（表4）

表4 55 ℃高溫處理對(duì)經(jīng)歷高溫鍛煉的玉米象保護(hù)酶活性的影響Table 4 The effect of heat treatment at 55 ℃on protective enzyme specific activities in S.zeamais with high temperature hardening

從表4 可知，在55 ℃高溫處理?xiàng)l件下，SOD 活性隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)略有升高，但相互之間無顯著差異，直到處理110 s 時(shí)，活性顯著下降.POD 活性在整個(gè)熱處理期間均顯著降低（P＞0.05），處理100 s 時(shí)活性最低.整個(gè)處理過程中，CAT 的活性變化與POD 相似.

3 討論

昆蟲在諸如高溫、低溫等逆境條件下，其體內(nèi)具有氧化能力的自由基會(huì)增加，當(dāng)積累到一定程度可導(dǎo)致生物功能分子的氧化損傷[14].SOD、POD和CAT 3 種酶能互相協(xié)調(diào)，使細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，避免細(xì)胞遭受自由基毒害，一旦這種平衡受到破壞則可能造成細(xì)胞損傷，甚至死亡[9].本試驗(yàn)中，在4 種不同的熱處理溫度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米象體內(nèi)SOD 活性先升高后降低，表明適度的熱處理能使SOD 清除自由基的能力增強(qiáng)，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的熱處理則對(duì)SOD 活性產(chǎn)生抑制作用，這與高溫條件下椰心葉甲嚙小蜂成蜂體內(nèi)的SOD 活性變化情況一致，表明長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫，SOD 不能及時(shí)清除細(xì)胞中的超氧自由基[15].CAT 活性在熱處理初始階段較低，之后有所增強(qiáng).POD 活性的變化則因溫度不同而異，且在51 ℃熱處理?xiàng)l件下活性較強(qiáng).導(dǎo)致SOD、POD 和CAT 酶活性變化的原因可能是，熱處理?xiàng)l件下昆蟲活性氧增加，SOD 清除O2-形成H2O2，CAT 和POD 清除H2O2，避免其與O2-生成毒性更強(qiáng)的HO·，所以POD 和CAT 的活性變化較SOD 有一定的滯后性[9].熱處理溫度為55 ℃時(shí)，3種酶活性較低，表明試蟲體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)難以應(yīng)對(duì)氧化脅迫，導(dǎo)致自由基積累過多，使試蟲生命力降低[16].

適宜的高溫鍛煉能增強(qiáng)玉米象的耐高溫能力，綜合作者前期的工作，高溫鍛煉過的玉米象經(jīng)熱處理后，體內(nèi)POD 和CAT 活性整體上較未經(jīng)過高溫鍛煉的強(qiáng)，表明溫和的短時(shí)高溫鍛煉在一定程度上能增強(qiáng)保護(hù)酶清除自由基的能力.在我國(guó)部分地區(qū)，夏季最高溫度可達(dá)36 ℃以上，長(zhǎng)期生存在該環(huán)境下的昆蟲會(huì)有較強(qiáng)的耐高溫能力，增加了熱處理殺蟲的難度.由本試驗(yàn)結(jié)果可知，延長(zhǎng)熱處理時(shí)間和提高熱處理溫度能抑制昆蟲體內(nèi)SOD活性，降低O2-的清除速率，從而使害蟲自身的防御能力迅速下降，提高熱處理殺蟲效果.

生物體對(duì)外源性刺激的反應(yīng)機(jī)制是多方面的，且相互聯(lián)系、互相補(bǔ)充[17].POD 和CAT 作為保護(hù)酶系統(tǒng)的重要酶系，在氧化應(yīng)激中共同清除H2O2以維持自由基在較低水平.本試驗(yàn)中，4 種熱處理溫度下POD 活性的變化趨勢(shì)都不一樣，其原因究竟是不同溫度導(dǎo)致POD 合成發(fā)生變化，或是熱處理時(shí)間導(dǎo)致POD 活性改變，以及氧化修飾損傷影響其功能的發(fā)揮等，還有待進(jìn)一步研究[18].

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