李瑞芳，劉 帥，楊碩曄，蘇蘭利

（河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

真菌種類繁多、分布廣泛.雖然致病性真菌僅占少數，但危害巨大[1-3].目前深部真菌感染在臨床上已經上升為第三大感染性疾病[4].近年來，由于廣譜抗生素、免疫抑制劑、腎上腺皮質激素的廣泛使用和侵襲性操作的開展，以及HIV/AIDS、移植手術、癌癥等，對真菌抵抗能力減弱的免疫缺陷患者增多[5]，深部真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢，病死率高.唑類藥物是治療深部真菌感染的首選藥物，氟康唑是目前最常用的藥物，但其在應用過程中不斷出現耐藥，尤其是光滑念珠菌與克柔念珠菌，對氟康唑有天然耐藥性[6].伊曲康唑（Itraconazole）很少耐藥[7]，但由于水溶性和生物利用度低，臨床應用受到限制.伊曲康唑在pH 7 環(huán)境下水溶性低（大約1 ng/mL）[8-9]，酸性基質利于其溶解（pH 1 環(huán)境下為4 μg/mL），因此伊曲康唑常見用藥方式為口服.但口服給藥不適用于有惡心、嘔吐、胃腸道疾病患者和化療患者，因此注射針劑研究對擴大伊曲康唑用藥途徑具有重要意義.

藥物的納米劑型是一種新劑型，通常以兩親性高分子化合物為載體，與藥物以一定方式結合在一起，形成粒徑在500 nm 以內的納米粒（nanoparticles，NP），納米球（nano-spheres，NS），納米囊（nano-capsules，NC）等，也可以直接將原料藥物加工制成納米粒[10-11].與傳統(tǒng)分子藥物相比，納米藥物粒徑小，既能溶于水，又能克服生物屏障進入細胞，實現高療效[12]；比表面積大、鏈接或載帶的功能基團或活性中心多，可以實現治療與療效跟蹤同步化；具有多孔、中空、多層等結構特性，易于實現藥物緩釋控制等.因此，在保證藥效的前提下，由于藥物用量減少，可以減輕藥物的毒副作用，較易實現低毒性[13-14].本研究旨在研究伊曲康唑納米粒在小鼠體內代謝動力學變化，為伊曲康唑注射針劑的研發(fā)奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

伊曲康唑、DMSO：美國sigma 公司；聚合物5kPEGCA8:加利福尼亞大學戴維斯分校生化與分子醫(yī)學系Dr.Lam 實驗室；氯仿:分析純，蘇州津純化工有限公司；乙腈:HPLC 純，VBS 公司；昆明小鼠:18～22 g，雌雄各半，河南省實驗動物中心.

1.2 儀器設備

Waters 2695 高效液相色譜:美國沃特世公司;配置2475 熒光檢測器，Symmetry C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）.

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光-HPLC 色譜條件

流動相為乙腈-水（9∶1），流速1 mL/min，柱溫40 ℃，激發(fā)波長259 nm，發(fā)射波長365 nm，進樣量10 μL.

1.3.2 血藥的提取方法

小鼠眼眶取血0.8 mL，4 500 r/min 離心15 min，取上清血漿200 μL 于1.5 mL EP 管中，加入DMSO 50 μL，渦旋振蕩0.5 min；加入乙腈350 μL，渦旋3 min.將渦旋后的樣品12 000 r/min 離心10 min，上清液即為含有伊曲康唑的溶液.

1.3.3 血藥標準曲線的繪制

稱取伊曲康唑原藥1.44 mg，用DMSO 定容至100 mL，配制成初始濃度為14.4 μg/mL 的伊曲康唑標準品溶液.取適量加入血漿內，使終濃度分別 為36 ng/mL、144 ng/mL、576 ng/mL、2 304 ng/mL 和9 216 ng/mL，再將伊曲康唑從血漿中重新提取出來，進行熒光-HPLC 分析，以伊曲康唑濃度y（mg/mL）為縱坐標，出峰面積x 為橫坐標，按加權最小二乘法進行回歸，得到的回歸方程即為血藥濃度標準曲線.

1.3.4 血藥提取回收率、方法回收率和精密度試驗[15]

血藥提取回收率：空白小鼠血漿中分別加入適量伊曲康唑標準品溶液，配成伊曲康唑濃度分別為36 ng/mL、288 ng/mL、2 304 ng/mL 的低、中、高3 個濃度質控（QC）血樣各5 份，重新提取血漿中的伊曲康唑，取10 μL 進行熒光-HPLC，得伊曲康唑峰面積A1.另用DMSO 配制相應濃度的伊曲康唑標準液，不經處理，直接取10 μL，進行熒光-HPLC，得伊曲康唑峰面積A2.

伊曲康唑的血藥回收率=A1/A2×100%.

方法回收率：將血藥提取回收率試驗中得到的伊曲康唑峰面積A1代入回歸方程，求出伊曲康唑濃度.

方法回收率=（測得量/加入量）×100%.

血藥精密度試驗：取上述低、中、高3 個濃度質控血樣，于試驗的第1 天，將質控血樣中血藥含量分別測定5 次，得日內相對標準偏差（RSD）；然后將質控血樣中血藥含量連續(xù)測定5 d，得日間RSD.

RSD=（標準偏差/濃度平均值）×100%.

1.3.5 伊曲康唑納米粒制備

采用薄膜擴散法[16]制備伊曲康唑納米粒：稱取伊曲康唑原藥2 mg，多聚物5kPEGCA8 20 mg，用1 mL 氯仿溶解，置于10 mL 單頸圓底燒瓶中，旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸發(fā)約15 min，轉速為240 r/min，真空壓下降到1.3 MPa 后，維持20 min，抽干殘余氯仿.用pH 7.0 的0.02 mol/L 1 mL PBS 緩沖液溶解圓底燒瓶瓶壁上的膜狀物，所得混懸液用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為伊曲康唑納米?；鞈乙?

1.3.6 納米伊曲康唑血藥和組織樣品收集與藥物提取

取36 只小鼠，按30 mg/kg 尾靜脈單劑量注射納米粒型伊曲康唑，于給藥后0 min、20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h各取3 只，眼球采血，脫頸法處死，取組織.

血液藥物提取：按1.3.2 中方法提取.

組織藥物提?。喝〗M織（肝、腎、脾）以蒸餾水沖洗表面，擦干，稱質量，加入研缽中研磨成勻漿，加入200 μL 0.02 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.0），混勻，加入DMSO 50 μL，渦旋振蕩0.5 min；加入乙腈350 μL，渦旋3 min.將渦旋后的樣品12 000 r/min，離心10 min.上清液即為組織伊曲康唑樣品.

1.3.7 納米伊曲康唑藥物代謝動力學曲線及參數測定

將制備的血藥樣品和組織藥物樣品各10 μL進行熒光-HPLC 色譜分析，結果代入血藥標準曲線回歸方程，測出不同時間點的藥物濃度；將各時間點藥物濃度的平均值代入藥代動力學軟件WinNonlin 進行處理，計算主要藥代動力學參數如曲線下面積（AUC0-∞）、半衰期（t1/2z）、達峰時間（Tmax）、最大血藥濃度（Cmax）等.

2 結果與分析

2.1 伊曲康唑的熒光-HPLC 色譜行為

伊曲康唑標準品（3.2 μg/mL）、空白血漿、含藥血漿（小鼠靜脈注射伊曲康唑納米粒20 min 后的血漿樣品）進樣后的色譜見圖1.

由圖1 可知，小鼠血漿內源性物質不干擾伊曲康唑的測定，伊曲康唑的保留時間為3.415 min.

2.2 血藥標準曲線

以伊曲康唑濃度y（mg/mL）為縱坐標，出峰面積x 為橫坐標，按加權最小二乘法進行回歸，得到標準曲線：y=0.005x+29.52，R2=0.999，線性范圍36～9 216 ng/mL.

2.3 血藥提取回收率、方法回收率與精密度試驗

為判斷血漿中伊曲康唑提取前后濃度偏差程度，測定血藥提取回收率；為判斷血藥標準曲線的正確性，測定方法回收率；為判斷日內和日間樣品濃度重復性，測定日內精密度和日間精密度，結果如表1 所示.由表1 可知，RSD 均小于15%，方法符合樣品分析要求，穩(wěn)定可靠[15].

圖1 伊曲康唑血漿樣品熒光-HPLC 色譜Fig.1 The analysis of itraconazole in plasma by fluorescence-HPLC

表1 回收率和精密度測試結果(x±s，n=5)Table 1 Results of recovery rate and precision tests(x±s,n=5)

2.4 伊曲康唑藥物代謝動力學曲線及參數

將樣品進行熒光-HPLC，測出不同時間血液和組織藥物濃度.血液藥物濃度-時間曲線見圖2，組織藥物濃度-時間曲線見圖3.由圖2 和圖3 可知，納米粒型伊曲康唑給藥后，伊曲康唑迅速分布到各個臟器組織，前15 h 在各組織藥物分布較為均勻，具有相似的代謝動力學變化.有趣的是，伊曲康唑在血液和各組織中的含量于給藥24 h 后，又有輕微回升，大致趨勢為脾臟藥物含量＞腎臟藥物含量＞心臟藥物含量.出現此結果，是否與納米劑型有關，需要進一步研究.三唑類藥物為時間依賴性抗菌藥物，作用效果主要取決于血藥濃度高于MIC 的時間，其峰濃度并不很重要[17].伊曲康唑對白色念珠菌的MIC90 為0.5 μg/mL[18-20]，本研究中，伊曲康唑在體內的含量超過白色念珠菌MIC的時長分別為：血液，12 h；腎，31 h；脾，46 h；心，23 h，說明伊曲康唑納米粒進入體內能長時間發(fā)揮抗菌作用.

圖2 血漿中伊曲康唑的濃度-時間曲線Fig.2 The concentration-time curve of itraconaloze in plasma

將不同時間點藥物濃度的平均值輸入Win-Nonlin 軟件進行分析，計算主要藥代動力學參數，所得數據見表2.

圖3 各臟器中伊曲康唑的濃度-時間曲線Fig.3 The concentration-time curves of itraconazole in visceral organs

表2 伊曲康唑納米粒在血漿中的藥代動力學參數Table 2 The pharmacokinetic parameters of itraconazole in plasma

時曄等[21]制備的納米伊曲康唑AUC（0-∞）為8 710（μg·h）·L-1、Cmax為2 040 μg·L-1、t1/2為25.08 h；繆海軍等[22]制備的納米伊曲康唑AUC（0-∞）為（1 414.0±815.2）（μg·h）·L-1、Cmax為（81.4±60）μg·L-1、t1/2為（29.3±5.62）h；丁艷等[23]制備的納米伊曲康唑AUC（0-∞）為9 800（μg·h）·L-1、Cmax為1 322 μg·L-1、t1/2為69.315 h；王偉[24]制備的納米伊曲康唑AUC（0-∞）為（21 129.13±1 745.025）（μg·h）·L-1、Cmax為（632.92±46.84）μg·L-1、t1/2為（18.246±1.017）h.與文獻相比，文中制作的伊曲康唑納米粒的AUC（0-∞）、Cmax更高，Tmax小，說明小鼠對納米粒的吸收程度大，藥效強，但代謝快，原因可能是以5kPEGCA8 為載體的納米伊曲康唑溶解度增加，代謝加快.

3 結論

本研究以多聚物5kPEGCA8 作為包裹物，用薄膜擴散法制備伊曲康唑納米粒，采用熒光-HPLC法測定納米粒的藥代動力學特性，成功制備了伊曲康唑靜脈注射劑型，為伊曲康唑注射針劑的開發(fā)提供了參考.

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