楊永生，黃 婷，劉良忠*，賈維寶，曹宇翔，陳 琳

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

流行病學(xué)資料表明，慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為一個威脅全世界公眾健康的主要疾病[1]。據(jù)國際腎臟病學(xué)會預(yù)測，目前慢性腎病患者約占全人類總?cè)丝诘?0%[2]，慢性腎病已經(jīng)成為了一個威脅全世界公眾健康的主要疾病。大量的試驗證明：限制飲食中的蛋白攝入，給予CKD患者低蛋白膳食，可以延緩或防止慢性腎衰竭。FOUQUE D等[3]研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白飲食可減緩非糖尿病患者腎衰竭的速度；MINO M等[4]研究顯示，限制蛋白質(zhì)攝入量能有效地防止幼鼠腎功能衰竭；徐玉霞[5]研究發(fā)現(xiàn)，酮酸輔以低蛋白飲食能有效延緩慢性腎功能衰竭的進展，降低甲狀旁腺素。

人體中的磷主要由腎臟排泄，CKD患者由于腎臟損傷，體內(nèi)極易出現(xiàn)磷儲留，引發(fā)高磷血癥。高磷血癥會引起腎性骨病、繼發(fā)性甲旁亢，并且導(dǎo)致血管和軟組織的鈣化[6]，是影響CKD的重要危險因素。在針對高磷血癥的治療中，限制飲食中磷的攝入被視為首要的治療方法[7]。

大米是人類的主食之一，在我國以大米為主食的人口約占總?cè)丝诘?/3，但是稻米中的蛋白質(zhì)屬于非優(yōu)質(zhì)蛋白。因此，開發(fā)低蛋白、低磷的大米制品對CKD患者具有重要意義。目前，除去大米中蛋白質(zhì)的方法主要有：堿浸法、表面活性劑法、超聲波法、酶法[8]。超聲波法由于能耗高，不適于作為獨立提取方法，一般用于其他提取方法的輔助[9]。在對比堿浸法、表面活性劑法、酶法分離大米蛋白，制備大米淀粉的研究中發(fā)現(xiàn)，三種方法對大米蛋白的分離能力相近，但是酶法制得的大米淀粉，其顆粒的破損率小、粒徑小、形狀規(guī)整[10-11]。有研究表明，谷物中的磷大部分存在于蛋白質(zhì)中，因此，選擇一種合適的方法在脫除谷物中蛋白的同時，降低磷含量顯得至關(guān)重要。

本試驗以市售大米為原料，進行堿性蛋白酶水解，分析各種因素對磷殘留率和蛋白殘留率的影響，旨在找出最適的水解途經(jīng)，制備出低蛋白含量且低磷含量的大米粉，為后期功能性食品的開發(fā)提供原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：安徽白湖大米有限公司；堿性蛋白酶：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市百世化工有限公司；硫酸（分析純）：廣東光華化學(xué)廠有限公司；高氯酸（分析純）：天津市鑫源化工有限公司；硝酸（分析純）：開封東大化工有限公司；鉬酸銨（分析純）：天津市化學(xué)試劑四廠；對苯二酚（分析純）：上海山浦化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀（優(yōu)級純）：天津市化學(xué)試劑研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：金華市瑞華試驗儀器廠；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；Various EL元素分析儀：德國Elementar公司；電子天平（精度0.000 1 g）：瑞典梅特勒公司；722型分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；SpS2001F電子天平：梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；AR2140電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；LD5-10低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；DS-1高速組織搗碎機：上海標(biāo)本模型廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 低蛋白低磷大米粉的制備工藝

碎米→粉碎→加水浸泡→烘干（過100目篩）→酶解→離心→水洗→沉淀→干燥→粉碎→成品

1.3.2 操作要點

將大米粉碎后用1∶4（g∶mL）料液比加水在常溫條件下浸泡24 h，用鼓風(fēng)干燥箱50 ℃條件下干燥8 h，過100目篩制得大米粉。

取20 g大米粉，加入一定料液比的蒸餾水，再加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值，于一定溫度水解數(shù)小時。之后，將水解液離心（4 000 r/min、15 min），去上清液并刮掉沉淀表面暗灰色物質(zhì)，用蒸餾水清洗沉淀兩遍，再重復(fù)離心1次，去上清液并刮掉沉淀表面暗灰色物質(zhì)，然后用3倍于淀粉沉淀的蒸餾水將其溶解，調(diào)節(jié)pH值為7，再離心，棄上清液刮掉暗灰色上層，將剩余的沉淀放于鼓風(fēng)干燥箱中于50 ℃干燥12 h，過100目篩即得低蛋白低磷大米粉。

1.3.3 檢測方法

水分的測定：常壓干燥法[12]；灰分的測定：灰化法[13]；脂肪的測定：采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法；淀粉的測定：采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》中的酶水解法；蛋白質(zhì)的測定：元素分析法[14]；磷的測定：分光光度法[15]。

1.3.4 單因素試驗

（1）加酶量對水解效果的影響：取大米粉5份，在料液比為1∶6（g∶mL），溫度為50 ℃，pH值為9.0的條件下，分別加入底物質(zhì)量0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的堿性蛋白酶，水解5 h，離心、干燥后，取樣測定其蛋白質(zhì)和磷含量，確定最佳的加酶量。

（2）時間對水解效果的影響：取大米粉5份，在料液比為1∶6（g∶mL），溫度為50 ℃，pH值為9.0，堿性蛋白酶為底物質(zhì)量1.0%的條件下，分別水解3 h、5 h、7 h、9 h、11 h，離心、干燥后，取樣測定其蛋白質(zhì)和磷含量，確定最佳的水解時間。

（3）溫度對水解效果的影響：取大米粉5份，在料液比為1∶6（g∶mL），pH值為9.0，堿性蛋白酶為底物質(zhì)量1.0%的條件下，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水解5 h，離心、干燥后，取樣測定其蛋白質(zhì)和磷含量，確定最佳的水解溫度。

（4）pH對水解效果的影響：取大米粉5份，在料液比為1∶6（g∶mL），溫度為50 ℃，堿性蛋白酶為底物質(zhì)量1.0%的條件下，分別調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，水解5 h，離心、干燥后，取樣測定其蛋白質(zhì)和磷含量，確定最佳的pH值。

（5）料液比對水解效果的影響：取大米粉5份，分別按料液比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）溶解在水中，在溫度為50 ℃，pH值為9.0，堿性蛋白酶為底物質(zhì)量1.0%的條件下，水解5 h，離心、干燥后，取樣測定其蛋白質(zhì)和磷含量，確定最佳的料液比。

1.3.5 大米粉酶解工藝優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取溫度、加酶量、時間和pH值4個因素為試驗因素，以大米粉中的蛋白質(zhì)殘留率（Y1）和磷殘留率（Y2）為指標(biāo)，進行4因素3水平正交試驗，確定低蛋白低磷大米粉的最優(yōu)制備工藝。正交試驗設(shè)計見表1。

表1 酶解條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for hydrolysis conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.107 3x-0.000 4，R2=0.999 2，曲線相關(guān)性良好。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phosphorus

2.2 大米原料基本成分

對大米原料進行成分分析，其結(jié)果見表2。

表2 大米基本成分Table 2 Basic composition of ric e

2.3 單因素試驗結(jié)果及分析

2.3.1 加酶量對蛋白殘留率、磷殘留率的影響

圖2 加酶量對蛋白殘留率(A)和磷殘留率(B)的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on protein residual rate (A)and phosphorus residual rate (B)

由圖2A可知，隨著酶添加量的增加，蛋白的殘留率呈先下降后平緩的趨勢。在加酶量較少時，底物中蛋白質(zhì)不能被酶制劑充分水解，蛋白質(zhì)殘留率較高；隨著酶制劑的不斷增加，底物中蛋白質(zhì)被逐步水解；在加酶量達到1.2%時，底物中蛋白質(zhì)與酶制劑的結(jié)合達到了相對飽和，底物中蛋白質(zhì)被充分水解而釋放出來，蛋白質(zhì)殘留率達到較低水平，之后無明顯變化。由圖2B可知，加酶量對大米粉中磷殘留率的影響趨勢與對蛋白質(zhì)殘留率的影響趨勢基本一致。綜合考慮，將最適的加酶量定為1.2%。

圖3 時間對蛋白殘留率(A)和磷殘留率(B)的影響Fig.3 Effect of time on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

2.3.2 時間對大米粉蛋白殘留率、磷殘留率的影響

由圖3A可知，隨著時間的增加，蛋白的殘留率不斷下降，當(dāng)時間達到7 h之后，蛋白殘留率下降趨于平緩。在試驗初期，酶制劑與底物中大量的蛋白結(jié)合，水解速度迅速，隨著時間的延長，底物中的蛋白量變少，水解速度變低，蛋白殘留率下降趨勢變緩。由圖3B可知，隨著時間的延長，磷的殘留率呈不斷下降趨勢，在水解時間為7～9 h時，磷的殘留率變化不大。并且時間過長會嚴(yán)重增加成本。所以綜合考慮，將酶解的最佳時間定為7 h。

2.3.3 溫度對大米粉蛋白殘留率、磷殘留率的影響

由圖4A可知，隨著溫度的增加，蛋白的殘留率呈先下降后上升趨勢，當(dāng)溫度達到55 ℃時，蛋白的殘留率達到最低值0.51%。由此可知，酶制劑的最適溫度范圍在50～60 ℃之間，在這個最適范圍之外，酶制劑會出現(xiàn)變性失活，進而導(dǎo)致酶解速度變慢，蛋白殘留率偏大。由圖4B可知，隨著溫度的升高，磷的殘留率呈下降趨勢，當(dāng)溫度＞55 ℃之后，下降趨勢變緩。由于溫度過高會導(dǎo)致部分淀粉糊化，使得淀粉顆粒破裂，所制產(chǎn)品品質(zhì)變差。所以綜合考慮，將酶解的最適溫度定為55 ℃。

圖4 溫度對蛋白殘留率(A)和磷殘留率(B)的影響Fig.4 Effect of temperature on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

2.3.4 pH對大米粉蛋白殘留率、磷殘留率的影響

圖5 pH對蛋白殘留率(A)和磷殘留率(B)的影響Fig.5 Effect of pH on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

由圖5A可知，隨著pH值的增加，蛋白的殘留率不斷下降，當(dāng)pH值達到10.0以后，下降趨勢變緩。由此可知，在pH值為10.0～12.0時，酶制劑達到了相對的最高活性。但是，由于pH值＞10.0之后，會大大降低淀粉的糊化溫度，使部分淀粉在低溫下發(fā)生糊化，從而使淀粉顆粒破裂，增大破損淀粉的量，對所制產(chǎn)品品質(zhì)有很大影響。所以，最適pH值不宜超過10.0。從圖5B可知，隨著pH的增加，磷的殘留率不斷下降，說明pH值越大越有利于磷的溶出，考慮到產(chǎn)品的綜合品質(zhì)，將水解的最佳pH值定為10.0。

2.3.5 料液比對大米粉蛋白殘留率、磷殘留率的影響

圖6 料液比對蛋白殘留率(A)和磷殘留率(B)的影響Fig.6 Effect of solid to liquid ratio on protein residual rate (A)and phosphorus residual rate (B)

由圖6A可知，隨著料液比的增加，蛋白的殘留率呈先下降后上升趨勢。當(dāng)料液比為1∶6（g∶mL）時，其酶解效果最好，蛋白的殘留率達到最小值0.832%。料液比過小，會致使溶液的濃度過大，影響酶制劑與底物蛋白間傳質(zhì)的進行，進而使得水解速度過緩；料液比過大，會降低溶液濃度，使得酶的濃度變小，不利于底物中蛋白與酶制劑的結(jié)合，進而導(dǎo)致水解速度變慢。由圖6B可知，料液比對大米粉中磷殘留率的影響趨勢與對蛋白質(zhì)殘留率的影響趨勢基本一致。綜合考慮，將水解的最佳料液比定為1∶6（g∶mL）。

2.4 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，采用4因素3水平正交試驗對影響大米中蛋白殘留量和磷殘留量的主要因素進行分析，并優(yōu)化出較佳的工藝條件。正交試驗的試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4和表5。

由表3可知，以蛋白殘留率為考察指標(biāo)時，各影響因素大小依次為溫度＞加酶量＞pH值＞時間，最優(yōu)方案為溫度55 ℃，加酶量1.2%，時間9 h，pH值10.0；以磷殘留率為考察指標(biāo)時，各影響因素大小依次為pH值＞溫度＞加酶量＞時間，最優(yōu)方案為pH值10.0，溫度60 ℃，加酶量1.2%，時間9 h。由于蛋白酶在55 ℃和60 ℃時的活性均處于較高水平，但溫度過高會加速淀粉的糊化，破壞淀粉顆粒的完整性，不利于最終產(chǎn)品的綜合品質(zhì)。因此綜合考慮，低蛋白低磷大米粉的最佳酶解條件確定為A2B2C3D3，即溫度為55 ℃，加酶量為1.2%，時間為9 h，pH值為10.0，料液比為1∶6（g∶mL）。經(jīng)試驗驗證得出，在此條件下，制得的大米粉中蛋白殘留率為0.32%（脫蛋白率96.05%），磷殘留率為45.65 mg/100 g（脫磷率70.16%）。由表4可知，各因素對蛋白殘留率均有顯著影響，其中溫度影響最大，4個因素各水平間均有顯著性差異。由表5可知，4個因素中除時間外，pH值、溫度、加酶量均對磷殘留率有顯著性影響，其中pH值影響最大，3個因素各水平間均有顯著性差異。

表3 酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for hydrolysis conditions optimization

表4 蛋白殘留率正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results for phosphorus residual rate optimization

表5 磷殘留率正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results for phosphorus residual rate optimization

3 結(jié)論

以大米為原料，采用堿性蛋白酶水解大米粉，在脫去蛋白質(zhì)的同時，也可以使大米粉中磷的含量減少。在除去大米中磷含量的試驗中，溶液的溫度、pH值對磷的殘留率影響較大，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)溶液溫度、pH值，有利于減少大米中磷的含量。制備低蛋白低磷大米粉的最佳水解工藝為溫度55 ℃，加酶量1.2%，時間9 h，pH值10.0，料液比1∶6（g∶mL），在此條件下，得到的大米粉中蛋白殘留率為0.32%，磷殘留率為45.65 mg/100 g。

[1]劉曉琰，陸國紅，湯璐敏.中藥治療慢性腎病研究現(xiàn)狀[J].中國藥師，2007，10（6）：590-592.

[2]LEVEY A S,ATKINS R,CORESH J,et al.Chronic kidney disease as a global public health problem:approaches and initiatives—a position statement from kidney disease improving global outcomes[J].Kidney Int,2007,72(3):247-259.

[3]FOUQUE D,LAVILLE M,BOISSEL J P.Low protein diets for chronic kidney disease in non diabeticadults[J].Cochrane Database of Syst Rev,2009,3(2):25-28.

[4]MINO M,IHARA H,KOZAKI S,et al.Effects of low protein intake on the development of the remaining kidney in sub totally nephrectomized immature rats:expression of inducible and endothelial NO synthase[J].Med Mol Morphol,2010,43(2):116-122.

[5]徐玉霞.酮酸加低蛋白飲食對慢性腎功能衰竭合并甲狀旁腺素的作用[J].中國醫(yī)療前沿，2007，10（2）：32-33

[6]李貴森.慢性腎臟病患者高磷血癥的治療[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2014，23（3）：248-249

[7]李銀萍.慢性腎功能衰竭性骨病[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2012，30（1）：69-69.

[8]紀(jì)鳳娣，魯緋，王夫杰，等.大米蛋白提純的方法研究[J].中國釀造，2008，27（14）：113-115.

[9]蘆 鑫.高純度大米淀粉提取工藝與性質(zhì)研究[D].無錫：江南大學(xué)碩士論文，2007.

[10]易翠平，倪凌燕，姚惠源.大米淀粉的純化及性質(zhì)研究[J].中國糧油學(xué)報，2005，20（3）：5-8.

[11]李 玥，牟伯中，羅昌榮，等.不同分離方法對大米淀粉理化性質(zhì)的影響[J].安微農(nóng)業(yè)科技，2011，39（25）：15796-15798.

[12]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1997.

[13]張水華.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004.

[14]鐘國才，陳 威，吳軍輝，等.利用元素分析儀測定大米粗蛋白含量的方法探討[J].食品工業(yè)，2014，3（2）：158-159.

[15]陳志娟，蔡夢華，高素虹.食品中磷測定方法研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2009，15（12）：1204-1205.