方 穎，謝 渝，盧皓瑤，連曉東，林偉民，劉 欣，高向陽*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實驗教學(xué)中心，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

姜黃素類化合物是主要由姜科姜黃屬植物姜黃（Cuicuma longaL.）的根莖分離出來的酚類化合物，其中最為常見的是姜黃素（curcuminⅠ，CurⅠ）、單脫甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin Ⅱ，Cur Ⅱ）和雙脫甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin Ⅲ，Cur Ⅲ）[1]。據(jù)測定，姜黃根莖中姜黃素類化合物的含量約為1%～5%。姜黃色素的三種單體的含量比例分別為77%、18%和5%[2]?，F(xiàn)代研究表明，姜黃素作為一種有潛力的制藥配劑，具有多方面的生物與醫(yī)藥作用，如抗氧化、抗炎、抗突變、抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和降低血糖和低密度脂蛋白，并且有助于抑制腫瘤的形成和癌癥發(fā)生，阻止腫瘤的發(fā)展[3-5]。另一方面，姜黃色素的三種單體姜黃素，脫甲氧基姜黃素和二脫甲氧基姜黃素具有不同的生物活性，在高效薄層色譜分離基礎(chǔ)上進(jìn)行的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基抗氧化試驗，三者抗氧化活性的順序依次是姜黃素＞脫甲氧基姜黃素＞二脫甲氧基姜黃素[6]。最近研究證明，在基礎(chǔ)癌癥的化療治療過程中，發(fā)現(xiàn)姜黃素、脫甲氧基姜黃素和二脫甲氧基姜黃素能抑制對多種藥物呈耐藥性的相關(guān)蛋白和P-糖蛋白，并表現(xiàn)出理想的功效[7-8]。

目前市售的姜黃色素通常為姜黃素、脫甲氧基姜黃素及雙脫甲氧基姜黃素等多種物質(zhì)的混合物，分離純化得到姜黃色素單體，對進(jìn)一步闡釋其作用機(jī)理，推進(jìn)姜黃素的實際應(yīng)用具有重要意義。本實驗利用硅膠柱層析對中藥材姜黃飲片進(jìn)行分離純化研究得到了3種姜黃素單體（姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素），并應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對3種姜黃素單體進(jìn)行了定性分離分析，獲取高純度的單體成分，為今后應(yīng)用于姜黃素的藥理性質(zhì)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃飲片：廣州市內(nèi)某藥店；姜黃素對照品（純度≥98%）：成碩化學(xué)與玻璃儀器銷售公司；硅膠（100～200目）：青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司；DM301大孔樹脂：安徽三星樹脂科技有限公司；硅膠層析板（25 mm×75 mm）：青島海洋化工廠分廠；DiamonsilC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2-8電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；24 cm玻璃干燥器（含變色硅膠）：重慶益容玻璃制品有限公司；114型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：浙江瑞安市永歷制藥有限公司；SB-5200DTD超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；752紫外光柵分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；R205L星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫星海王生化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇超聲波法制備姜黃色素粗提取物

將姜黃藥材粉碎后用丙酮脫油，稱取適量，加入適量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡過夜，保鮮膜封住瓶口，以防乙醇揮發(fā)；室溫條件下，超聲提取2次，超聲功率為90%，超聲頻率為40 kHz，每次提取30 min，合并提取液，測定粗提液中姜黃素的濃度。

1.3.2 姜黃色素含量測定方法

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，得到姜黃色素最大吸收峰在波長422 nm處。精密稱取40 ℃干燥12 h的姜黃素對照品9 mg左右，以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶解后，配制成1.44 μg/mL、3.60 μg/mL、5.76 μg/mL、7.20 μg/mL、9.00 μg/mL、14.40 μg/mL和18.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以空白作參比，在波長422 nm處測定各管吸光度值，以質(zhì)量濃度C（x）對吸光度值（y）進(jìn)行回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.160 9x-0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3。

1.3.3 大孔樹脂的動態(tài)吸附

姜黃素粗提液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用DM301大孔樹脂進(jìn)一步純化。大孔樹脂的純化工藝如下：最佳上樣液質(zhì)量濃度309.5 μg/mL，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行解吸附，上樣后待提取液均進(jìn)入樹脂柱，靜置30 min。先用蒸餾水洗至流出液無色，再用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗脫，分段收集洗脫液，在波長422 nm處測定每管洗脫液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其中姜黃素的含量，以姜黃素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，管號為橫坐標(biāo)，繪制姜黃素大孔樹脂洗脫曲線。合并高峰濃度的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，用硅膠薄層層析法監(jiān)測純化的結(jié)果。洗脫液濃縮干燥后得純化后總姜黃素樣品，備用。

1.3.4 硅膠柱層析分離姜黃素單體

參考秦曉燕等[9-10]的方法做進(jìn)一步改良，取經(jīng)過大孔樹脂純化后的總姜黃素提取物進(jìn)行硅膠柱層析。硅膠柱柱徑為2 cm，硅膠柱高約17 cm，采用干法上樣法，姜黃素樣品10 mg加少量甲醇溶解，再加硅膠拌樣（姜黃素與硅膠的比例約為1∶2），待甲醇揮干后，研磨使之成松散均勻的吸附有姜黃素的硅膠粉末，打開硅膠柱下口，使展開劑剛好覆蓋于硅膠柱表面，將姜黃素的硅膠粉末輕輕撒在硅膠層上面，可再撒上少量硅膠以穩(wěn)定粉末；先用氯仿為洗脫液洗脫，然后以氯仿-甲醇（99∶1，V/V）混合液為洗脫劑洗脫，從有亮黃色溶液流出時，開始收集流出的溶液。每10 mL為一管，分3個梯度進(jìn)行洗脫。第一個梯度氯仿-甲醇（99∶1，V/V）洗脫時，可看到硅膠柱頂端有明顯的色素帶被洗下，洗至無明顯黃色液體流出時，更換第二個梯度氯仿-甲醇（95∶5，V/V），此時硅膠柱頂端出現(xiàn)另一個顏色稍淺的色素帶，將該色素帶洗脫完全后，更換第三個梯度氯仿-甲醇（80∶20，V/V）。收集洗脫液，各管洗脫液在波長422 nm處測定吸光度值，以姜黃素吸光度值A(chǔ)422nm為縱坐標(biāo)，管號為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算三種姜黃素單體的含量。根據(jù)淋洗曲線，將峰值部分的洗脫液合并，參考ZHANG J S等[11]的方法，利用薄層層析法檢驗其組分。

1.3.5 樣品中姜黃素的相關(guān)計算

采用硼酸比色法，測定總姜黃素類粗提液在波長515 nm處的吸光度值，計算乙醇超聲波提取姜黃素的得率以及大孔樹脂吸附純化后姜黃素的得率，計算公式如下：

式中：A1為乙醇超聲波提取姜黃素的得率，%；V0為兩次過濾合并得到粗提液的總體積，mL；C1為粗提液稀釋500倍后含有姜黃素的總質(zhì)量濃度，μg/mL；m為脫油姜黃粉末的質(zhì)量，g。

式中：A2為大孔樹脂吸附純化后姜黃素的得率，%；m0為兩次過濾合并得到粗提液中姜黃素的總含量，mg；V3為洗脫液總體積，mL；C3為洗脫液所含姜黃素的總質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.6 姜黃色素三種單體的HPLC分析

方法[12-13]改良色譜條件：色譜柱為Diamonsil[C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶0.4%冰醋酸（48∶52，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為15 μL；檢測溫度為30 ℃。

取1 mg/mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用甲醇溶解并定容于5 mL容量瓶），經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液，精密稱取10 μL、12 μL、14 μL、15 μL、16 μL、18 μL、20 μL，相當(dāng)于姜黃素含量10 μg、12 μg、14 μg、15 μg、16 μg、18 μg、20 μg，在選定的HPLC條件下進(jìn)樣分析，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，姜黃素含量（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，確定硅膠柱層析洗脫液的進(jìn)樣量。在選定的HPLC條件下對洗脫液進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃色素提取物的大孔樹脂純化分析

圖1 姜黃素的DM301大孔樹脂洗脫曲線Fig.1 Elution curve of curcuminoids purified by macroreticular resins DM301 adsorption

由圖1可知，洗脫液中姜黃素質(zhì)量濃度從第4管開始迅速增大，到第9管達(dá)到峰值，隨后質(zhì)量濃度下降也較快，洗脫峰高且窄，拖尾現(xiàn)象不太嚴(yán)重。到第80管之后洗脫液黃顏色很淺，認(rèn)為姜黃素質(zhì)量濃度變化不大，含量極少。合并所有洗脫液，測定總體積及姜黃素總質(zhì)量濃度，計算姜黃素粗提液得率為58.09%，有關(guān)文獻(xiàn)用類似的純化工藝得到46.31%的[14]，表明經(jīng)改良用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇要比用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫效果好。

以氯仿-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑對大孔樹脂吸附后的姜黃素進(jìn)行薄層層析分析。合并吸光度值較高的幾管姜黃素洗脫液，濃縮后進(jìn)行薄層點板，展開劑上行展開5.2 cm。由圖2可見，濃縮后的姜黃素洗脫液經(jīng)薄層分離后，在自然光下呈現(xiàn)三個黃色斑點，與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品對照一致，說明洗脫液與標(biāo)準(zhǔn)品成分一致，初步判斷為姜黃素三種單體，雙脫甲氧基姜黃素、單脫甲氧基姜黃素、姜黃素的Rf值分別為0.46、0.65、0.88，兩兩之間相差大約0.2，與秦曉燕等[9]研究結(jié)果相吻合，說明經(jīng)過大孔樹脂的動態(tài)吸附，得到純化后的總姜黃素，并且分離效果好。

圖2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品與大孔樹脂吸附洗脫液的薄層層析結(jié)果Fig.2 Thin layer chromatography results of curcumin standard and eluent prepared by macroreticular resins adsorption

2.2 三種姜黃素單體硅膠柱層析結(jié)果分析

姜黃素濃縮液經(jīng)過不同梯度氯仿-甲醇洗脫液硅膠柱層析后，分離洗脫曲線見圖3。

圖3 姜黃素的硅膠柱層析分離洗脫曲線Fig.3 Elution curve of curcuminiods separated by silica gel column chromatography

由圖3可知，硅膠柱層析洗脫曲線直觀顯現(xiàn)出洗脫過程中各組分流出的先后順序，更換洗脫液梯度，即改變洗脫液的極性，可得到3個色素帶，故在洗脫曲線上主要呈現(xiàn)3個峰。

圖4 各梯度峰值處洗脫液的薄層層析結(jié)果Fig.4 Thin layer chromatography results of eluent after gradient elution at each peak

將峰值附近的洗脫液合并、濃縮，濃縮峰值附近的洗脫液在薄層層析點板，以（氯仿∶甲醇∶甲酸=96∶4∶0.7，V/V）的混合液為展開劑展開，合并具有相同Rf 值的洗脫液組組分，結(jié)果如圖4所示，表明在不同極性的梯度層析后，姜黃素、單脫甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素三個姜黃素單體均得到較好的分離。

將三種成分各自的合并液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷卻，得到各單體的晶體，稱量姜黃素單體、單脫甲氧基姜黃素單體、雙脫甲氧基姜黃素單體的質(zhì)量分別為6.42 mg、1.94 mg和1.57 mg。三種單體的質(zhì)量百分比分別為64.2%、19.4%和15.7%（進(jìn)行硅膠柱層析的姜黃素總質(zhì)量為10 mg）。

2.3 姜黃色素的高效液相色譜分析

2.3.1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜分析

在選定的HPLC條件下，將1 mg/mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣10～20 μL，選擇適宜進(jìn)樣量。以1 mg/mL姜黃素溶液（即總姜黃素含量為15 μg）進(jìn)樣15 μL為例，HPLC檢測圖譜見圖5。

圖5 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of curcumin standard

由圖5可知，通過色譜柱姜黃素3個單體的出峰時間在12.500～17.500 min間，其中雙脫甲氧基姜黃素Cur Ⅲ出鋒時間為12.913 min，單脫甲氧基姜黃素Cur Ⅱ出峰時間為14.501 min，姜黃素Cur Ⅰ出峰時間為16.264 min。研究結(jié)論與程勻等[15]研究結(jié)果吻合。

將對應(yīng)的姜黃素單體以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，總姜黃素含量（x）為橫坐標(biāo)繪制單體的高效液相測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 姜黃素三種單體峰面積的高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 HPLC standard curve of peak area of three monomers

如圖6所示，姜黃素峰面積的線性回歸方程為y=1.00×106x+2.00×106，R2=0.996 7；單脫甲氧基姜黃素峰面積的線性回歸方程為y=3.03×105x+3.53×105，R2=0.993 7；雙脫甲氧基姜黃素峰面積的線性回歸方程為y=5.70×104x-6.95×104，R2=0.994 9。總姜黃素在含量10～18 μg范圍內(nèi)三種單體各自的峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.993。

2.3.2 姜黃素三種單體的高效液相色譜分析

在選定的HPLC條件下，對姜黃素樣品分離得到的三種單體進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖7。

圖7 硅膠層析柱氯仿-甲醇(99∶1)(A)、(95∶5) (B)及(80∶20) (C)洗脫液的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of chloroform-methanol (99∶1) (A),(95∶5) (B) and (80∶20) (C) eluent separated by silica gel column chromatography

由圖7與圖5可看出，純化所得的三個單體CurⅠ、CurⅡ、Cur Ⅲ與標(biāo)準(zhǔn)對照品中的保留時間相吻合。而硅膠柱層析中第一個梯度氯仿-甲醇（99∶1）洗脫下來的組分出峰時間也在16.198 min，說明氯仿∶甲醇體積比為99∶1時恰好能洗脫下總姜黃素中的CurⅠ。第二個梯度氯仿-甲醇（95∶5）洗脫下來的組分有兩個小峰，其出峰時間分別為14.543 min、16.316 min，故判斷該組分中含有CurⅠ和Cur Ⅱ；第三個梯度80∶20洗脫下來的組分有兩個小峰，其出峰時間分別為12.913 min、14.516 min，故判斷該組分中含有CurⅡ和Cur Ⅲ。

3 結(jié)論

采取了以乙醇超聲波法浸提姜黃飲片提取姜黃素，超聲提取2次，每次提取時間為30 min，超聲功率為90%，超聲頻率為40 kHz，得到姜黃素濃縮液，隨后以DM301大孔樹脂吸附純化姜黃素的技術(shù)穩(wěn)定可行，姜黃素轉(zhuǎn)移率為58.09%。利用硅膠層析柱進(jìn)一步分離姜黃素3種單體成分，姜黃素、脫甲氧基姜黃素及雙脫甲氧基姜黃素質(zhì)量百分比分別為64.2%、19.4%和15.7%，得率較高；薄層層析檢測結(jié)果顯示經(jīng)柱層析分離的各單體斑點明顯、均一，純度較高，說明硅膠柱層析達(dá)到了理想的分離效果。通過高效液相色譜檢測結(jié)果顯示本實驗所采用的不同極性的梯度硅膠柱層析法可對3種單體進(jìn)行充分分離，對于姜黃中藥飲片中姜黃素成分的分離純化是一種可行有效的參考方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]JAYAPRAKASHA G K,RAO L J M,SAKARIAH K K,et al.Improved HPLC method for the determination of curcumin,demethoxycurcumin,and bisdemethoxycurcumin[J].J Agr Food Chem,2002,50(13):3668-3672.

[2]CHATTOPADHYAY I,BISWAS K,BANDYOPADHYAY U,et al.Turmeric and curcumin:Biological actions and medicinal applications[J].Curr Sci,2004,87(1):44-53.

[3]HIMESH S,SHARAN P S,MISHRA K,et al.Qualitative and quantitative profile of curcumin from ethanolic extract ofCurcuma longa[J].Int Res J Pharm,2011,2(4):180-184.

[4]DUVOIX A,BLASIUS R,DELHALLE S,et al.Chemopreventive and therapeutic effects of curcumin[J].Cancer Lette,2005,223(2):181-190.

[5]MAHESHWARI R K,SINGH A K,GADDIPATI J,et al.Multiple biological activities of curcumin:a short review[J].Life Sci,2006,78(18):2081-2087.

[6]POZHARITSKAYA O N,IVANOVA S A,SHIKOV A N,et al.Separation and free radical-scavenging activity of major curcuminoids ofCurcuma longausing HPTLC-DPPH method[J].Phytochem Anal,2008,19(3):236-243.

[7]CHEARWAE W,WU C P,CHU H Y,et al.Curcuminoids purified from turmeric powder modulate the function of human multidrug resistance protein 1(ABCC1)[J].Cancer Chemoth Pharm,2006,57(3):376-388.

[8]CHEARWAE W,ANUCHAPREEDA S,NANDIGAMA K,et al.Biochemical mechanism of modulation of human P-glycoprotein (ABCB1)by curcumin Ⅰ,Ⅱ,and Ⅲpurified from turmeric powder[J].Biochem Pharmacol,2004,68(10):2043-2052.

[9]秦曉燕，龔菊梅，陳衛(wèi)東.總姜黃素3 種單體高純度同時分離方法[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，31（2）：73-77.

[10]PERAT-ALMEID L,CHERUBINO A P F,ALVES R J,et al.Separation and determination of the physico-chemical characteristics of curcumin,demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin[J].Food Res Int,2005,38(8-9):1039-1044.

[11]ZHANG J S,GUAN J,YANG F Q,et al.Qualitative and quantitative analysis of four species ofCurcumarhizomes using twice development thin layer chromatography[J].J Pharmaceut Biomed,2008,48 (3):1024-1028.

[12]ZHAN P Y,ZENG X H,ZHANG H M,et al.High-efficient column chromatographic extraction of curcumin fromCurcuma longa[J].Food Chem,2011,129(2):700-703.

[13]INOUE K,NOMURA C,ITO S,et al.Purification of curcumin,demethoxycurcumin,and bisdemethoxycurcumin by high-speed countercurrent chromatography[J].J Agr Food Chem,2008,56(20):9328-9336.

[14]程光明.姜黃素的提取純化、脂質(zhì)體的制備和組織分布的研究[D].武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院碩士論文，2008.

[15]程 勻，袁麗蘋.高效相色譜法同時測定協(xié)日嘎四味湯膠囊中姜黃素、脫甲氧基姜黃素、二脫甲氧基姜黃素的含量[J].中南藥學(xué)，2011，9（5）：335-338.