李學(xué)偉，朱新貴*，梁姚順，曾小波

（李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東 江門 529156）

大豆是釀造醬油的主要原料，包括全大豆和脫脂大豆。全大豆和脫脂大豆的主要成分差異是有機(jī)溶劑浸出的油脂類物質(zhì)，主要包括油脂、磷脂、游離脂肪酸、生育酚（維生素E）、植物固醇和微量碳?xì)浠衔锏扔椭煞?，其中油脂、磷脂和游離脂肪酸占到了大豆總脂溶性物質(zhì)的96.8%以上[1-2]。全大豆的相對(duì)價(jià)格較高，而脫脂大豆作為油脂工業(yè)的副產(chǎn)物，價(jià)格相對(duì)便宜。但使用脫脂大豆制作的醬油風(fēng)味通常明顯比使用全大豆釀制的醬油差，風(fēng)味物質(zhì)如醇類、酯類和雜環(huán)酮類等物質(zhì)種類和含量都相對(duì)較少。目前世界醬油年產(chǎn)量已達(dá)800萬t，其中中國約600萬t，而多數(shù)優(yōu)質(zhì)醬油和出口醬油仍在使用全大豆[3-6]。

中國傳統(tǒng)醬油釀造周期長，3～6個(gè)月不等，根據(jù)脂質(zhì)一般氧化分解規(guī)律，含不飽和脂肪酸的大豆脂質(zhì)在曬露發(fā)酵過程中受氧、光照、高溫、金屬離子和脂肪酶等作用，極易形成氫過氧化物，隨后降解成短鏈脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、烷烴和烯烴等化合物。并可進(jìn)一步氧化或環(huán)化成醛、酮、雜環(huán)化合物、內(nèi)酯以及烷基呋喃等[7-8]，雖然這些成分可能含量很低，但由于口味閾值低，是不可忽視的風(fēng)味成分[9]。另外，脂質(zhì)降解生成的各種脂肪酸與醬醪中的乙醇重新生成小分子酯類，此酯類化合物具有芳香香氣[10-11]。長期以來，大豆油脂類成分在醬油釀造過程中對(duì)醬油品質(zhì)的影響只是在感官差異分析上[12-13]，缺乏在機(jī)理上探究油脂類成分代謝與醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成關(guān)系。本研究分別以全大豆和脫脂大豆為主要原料進(jìn)行釀造醬油試驗(yàn)，對(duì)比分析其醬油品質(zhì)的差異；并利用GC-MS對(duì)醬油揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，闡明2種醬油揮發(fā)性香氣物質(zhì)的差異，為研究大豆油脂類成分在醬油釀造過程中的變化和對(duì)醬油風(fēng)味的影響提供初步分析數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全大豆、脫脂大豆、米曲霉（Aspergillus oryzae）：由李錦記（新會(huì)）食品有限公司提供。

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、葡萄糖、重鉻酸鉀等：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1100紫外可見光分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司；PAL-α Brix計(jì)：日本ATAGO公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；794全自動(dòng)滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；TRACE GC-MS-2000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Finnigan公司；HP-INNOWAX毛細(xì)管柱：上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 全大豆和脫脂大豆釀造醬油的制備

根據(jù)大豆和脫脂大豆的總氮含量，調(diào)節(jié)各醬油釀造原料的總氮，使原料中的總氮含量保持一致。采用高鹽稀態(tài)釀造醬油工藝，原料制作大曲后進(jìn)行天然曬露釀造，醬油釀造發(fā)酵90 d。

1.3.2 醬油常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AN）、總氮、總酸、氯化鈉、pH值、波長530 nm條件下的色澤A530nm（稀釋10倍）和感官評(píng)定（每項(xiàng)最高分為10分）均按GB 18186—2000《釀造醬油》的方法測(cè)定；還原糖按GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》的方法測(cè)定；固形物采用Brix計(jì)測(cè)定。

1.3.3 醬油揮發(fā)性成分測(cè)定

固相微萃?。喝悠?0 mL密封于100 mL頂空樣品瓶，置于40 ℃水浴中電磁攪拌，固相微萃取纖維頂空萃取40 min，250 ℃解吸3 min后進(jìn)樣。

氣相色譜分析條件：HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣He，流速1.0 mL/min；程序升溫，起始溫度45 ℃保持5 min，升溫速率5 ℃/min，溫度至200 ℃，保持15min，升溫速度10 ℃/min，最終溫度220℃，保持5 min；汽化室溫度220 ℃，進(jìn)樣量0.8 μL。

質(zhì)譜分析條件：電離離子源（electron ionization，EI），電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，電子倍增器電壓350 V，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～335 amu。

數(shù)據(jù)處理：試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件完成，在NIST譜庫（107 000個(gè)化合物的數(shù)據(jù)）和Wiley譜庫（320 000個(gè)化合物的數(shù)據(jù)，Version6.0）對(duì)未知化合物進(jìn)行檢索并計(jì)算匹配度，只有當(dāng)正反匹配度均＞800（最大值為1 000）時(shí)才能確證該物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油常規(guī)指標(biāo)測(cè)定分析

醬油天然曬露釀造90 d后，測(cè)定醬油的常規(guī)指標(biāo)。全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油的常規(guī)指標(biāo)分析見表1。

表1 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油常規(guī)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of physiochemical properties of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

由表1可知，全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油的氨基酸態(tài)氮、總氮、pH值、NaCl、可溶性固形物含量之間沒有顯著差異（P＞0.05），而總酸、色澤A530nm和還原糖之間存在顯著差異（P＜0.05）。由于全大豆和脫脂大豆釀造醬油的原料總氮和釀造工藝一致，所以氨基酸態(tài)氮、總氮、Na-Cl和可溶性固形物含量沒有明顯差異；脫脂大豆釀造醬油的總酸含量較高，有研究表明，醬油有機(jī)酸主要來自原料和微生物的代謝，全大豆及脫脂大豆以檸檬酸為主，約占有機(jī)酸的70%～80%，其次是焦性谷氨酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸及乙醇酸，但脫脂大豆中的總有機(jī)酸量比全大豆高1.5倍[9]，這可能是導(dǎo)致脫脂大豆釀造醬油總酸含量較高的原因；對(duì)比醬油色澤，脫脂大豆釀造醬油顏色較深，與其還原糖含量較高有一定關(guān)系，在氨基酸和還原糖的存在下，發(fā)酵釀造過程中容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，并生成褐色或黑色素物質(zhì)。此外，脫脂大豆釀造醬油的還原糖含量較高[14]，可能原因是脫脂大豆比全大豆能更好地誘導(dǎo)淀粉酶增加。

根據(jù)感官鑒定標(biāo)準(zhǔn)，感官小組對(duì)全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油進(jìn)行了感官品評(píng)，結(jié)果如表2所示。

表2 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

由表2可知，經(jīng)感官鑒評(píng)，全大豆釀造醬油風(fēng)味顯著優(yōu)于脫脂大豆釀造醬油。兩種醬油相比，香氣和滋味差異極顯著，全大豆釀造醬油整體滋味協(xié)調(diào)，醇香、醬香濃郁，而脫脂大豆釀造醬油滋味一般，酸味較強(qiáng)，醇香和醬香較淡。此外，脫脂大豆釀造醬油的色澤較深。

2.2 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油主要揮發(fā)性成分比較

采用固相微萃取技術(shù)對(duì)醬油揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，并利用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的總離子流圖見圖1。

圖1 全大豆(A)和脫脂大豆(B)釀造醬油主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of GC-MS analysis of the soy sauce produced from whole soybeans (A) and defatted soybeans (B)

由圖1可知，全大豆釀造醬油的主要揮發(fā)性成分較豐富，物質(zhì)的定性和含量差異（峰面積歸一法）見表3。

由表3可知，本試驗(yàn)共鑒定出香氣物質(zhì)47種，其中醇類15種，酯類12種，酸類5種，酮類5種，酚類3種，醛類2種，吡咯類2種，其他3種。雖然全大豆醬油和脫脂大豆醬油揮發(fā)性風(fēng)味成分是相同的，但其相對(duì)含量存在較大差異。

全大豆釀造醬油中酯類含量比脫脂大豆釀造醬油高，特別是其中的高級(jí)酯類物質(zhì)，包括乳酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯和亞油酸乙酯。對(duì)比脫脂大豆釀造醬油，全大豆釀造醬油的原料大豆中含有約18%的油脂類成分，可能這些成分在醬醪中被微生物產(chǎn)的脂肪酶系或在自然氧化的條件下分解成游離的脂肪酸和甘油、單甘酯、甘油二酯，而大豆油脂的降解產(chǎn)物脂肪酸（即十二酸、十四酸、十五酸、十六酸、十八酸、油酸等）可進(jìn)一步與發(fā)酵液中的醇類物質(zhì)重新發(fā)生酯化反應(yīng)生成新的酯類物質(zhì)（如十四酸乙酯、十六酸乙酯等）。酯類物質(zhì)（特別是乙基酯）不但具有果香，而且能夠掩蓋其他化合物散發(fā)出來的不良香氣[15-16]。此外，脂肪酸在釀造后期繼續(xù)氧化分解形成的小分子物質(zhì)也可能是構(gòu)成醬油復(fù)雜風(fēng)味成分的重要來源。據(jù)研究表明，脂質(zhì)在釀造過程形成特殊的風(fēng)味成分在我國豉香型白酒香氣成分的研究中已有大量報(bào)道，此釀造工序中需要加入“肥豬肉”浸泡陳釀，脂質(zhì)的氧化使酒體帶有濃郁的豉香味，同時(shí)由于酒中含有大量的乙醇，產(chǎn)生的高級(jí)脂肪酸乙酯能增加酒體的豐滿感、延長后味，此種酒因浸泡豬肉脂肪產(chǎn)生獨(dú)特的豉香風(fēng)味而得名[17-18]。曾新安等[19]采用GC-MS技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)脂肪中的不飽和脂肪酸非?；顫?，在酒中發(fā)生氧化分解等一系列反應(yīng)，生產(chǎn)八碳、九碳等脂肪香味（肉香）小分子脂肪酸乙酯，除了β-苯乙醇外，脂質(zhì)氧化形成的9,9-二乙氧基壬酸乙酯被認(rèn)為是豉香型白酒中重要的特征香氣成分。因此，由于風(fēng)味成分的提取和檢測(cè)方法的限制，只有部分酯類化合物被檢測(cè)到，但對(duì)于全大豆釀造醬油濃郁的豉香風(fēng)味與全大豆18%左右的油脂類物質(zhì)在參與醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成必然具有重要作用。

表3 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油主要揮發(fā)性成分比較分析Table 3 Comparison of the main volatile flavor components of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

續(xù)表

在檢測(cè)出的5種揮發(fā)性酸類物質(zhì)中，全大豆釀造醬油中的乙酸、異丁酸和異戊酸含量較高，而己酸和辛酸的含量比脫脂大豆釀造醬油略低。一般來說，有機(jī)酸有增進(jìn)風(fēng)味的作用，除了主要依靠原料和微生物代謝產(chǎn)物的積累外，還有一部分作為微生物繁殖所需能源而被消耗掉。全大豆釀造醬油中的小分子酸含量較高，酸類化合物對(duì)醬油香氣具有一定的緩和作用，一些低分子的酸類主要是由脂肪酸的進(jìn)一步氧化降解生成的，也有部分是由乳酸菌和酵母發(fā)酵代謝作用產(chǎn)生的[9]。但對(duì)比表1中的醬油總酸，全大豆釀造醬油中的總酸含量較低，學(xué)者認(rèn)為其理由是全大豆所生成的脂肪酸有抑制有機(jī)酸細(xì)菌類的產(chǎn)酸作用，而細(xì)菌卻是發(fā)酵醪中產(chǎn)酸的主力，證明原料的不同會(huì)使產(chǎn)酸結(jié)果不同[9]。

醬油中共檢測(cè)5種呋喃（酮）類化合物和2種吡咯（雜環(huán)）類化合物，這7種化合物在全大豆釀造醬油均有較高的含量。呋喃（酮）類化合物和雜環(huán)類化合物一般被認(rèn)為是醬油特有的香氣成分。3-羥基-2-丁酮具有強(qiáng)烈的奶油、脂肪、白脫樣香氣，高度稀釋后有令人愉快的奶香氣。呋喃（酮）化合物具有焦糖色香氣，主要為酵母代謝及美拉德反應(yīng)形成的產(chǎn)物[15，20-21]。表3的結(jié)果表明，以全大豆為原料的釀造醬油，更有利于呋喃（酮）類化合物和雜環(huán)類化合物的生成。

醬油中主要檢測(cè)3種酚類化合物和2種醛類化合物。據(jù)研究表明，酚類化合物是在發(fā)酵過程中通過曲霉降解和酵母發(fā)酵生成，是醬油的重要風(fēng)味成分。其中愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基苯酚均是天然發(fā)酵醬油中的關(guān)鍵的香氣物質(zhì)[9]。由表3的檢測(cè)結(jié)果可見，這三種酚類化合物在全大豆釀造醬油中均有非常高的含量。低分子質(zhì)量揮發(fā)醛的2個(gè)主要來源是氨基酸降解和微生物的轉(zhuǎn)化作用，在2種醬油中均檢測(cè)到被認(rèn)為具有焦糖和蜂蜜風(fēng)味的化合物苯甲醛和α-亞乙基-苯乙醛[20]。全大豆釀造醬油中的苯甲醛含量偏低，但α-亞乙基-苯乙醛含量較高。

醬油中主要檢測(cè)出15種醇類化合物，對(duì)比2種釀造醬油，全大豆釀造醬油中除了1,3-丁二醇、糠醇和苯甲醇外，其他醇類化合物的含量均較低。醇類化合物主要來自酵母代謝和大豆油脂的降解，是形成釀造醬油香氣成分的重要來源[9]。全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油中不同化學(xué)成分種類的相對(duì)含量比較見表4。

表4 全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油中不同化學(xué)成分種類的相對(duì)含量比較Table 4 Relative contents of chemical compounds in different constituents of soy sauce produced from whole soybeans and defatted

由表4可見，脫脂大豆釀造醬油中仍含有較高的醇類化合物，這可能是脫脂大豆醬醪中酵母繁殖代謝后的產(chǎn)物由于缺少脂肪酸或小分子酸的酯化作用，仍然大量保存在醬油中，此結(jié)果可能是導(dǎo)致脫脂大豆醬油中的醇類物質(zhì)的含量偏高的主要原因。

綜合分析表明，全大豆和脫脂大豆的主要成分差異是有機(jī)溶劑浸出的油脂類物質(zhì)，而釀制出醬油的風(fēng)味卻差異顯著，通常采用全大豆制作的醬油其風(fēng)味要優(yōu)于采用脫脂大豆制作的醬油。通過比較分析2種醬油的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，全大豆釀造醬油中的酯類化合物、酸類化合物、酚類化合物及其他化合物均有非常高的含量。酯類化合物不但具有果香，而且高級(jí)酯類能使醬油具有濃厚味道，對(duì)增加后味是必要的。因此，全大豆油脂類物質(zhì)在參與醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成必然具有重要作用。根據(jù)脂質(zhì)一般氧化分解規(guī)律，含不飽和脂肪酸的大豆脂質(zhì)在曬露發(fā)酵過程中可氧化或環(huán)化成醛、酮、雜環(huán)化合物、內(nèi)酯以及烷基呋喃等[7-8]，雖然這些成分可能含量很低，但由于口味閾值低，是不可忽視的風(fēng)味成分[9]。另外，脂質(zhì)降解生成的各種脂肪酸與醬醪中的乙醇重新生成小分子酯類，此類酯化合物具有芳香香氣[10-11]。醬油中很多酸類化合物除了部分來自乳酸菌和酵母發(fā)酵代謝作用產(chǎn)生外，也來自脂肪酶對(duì)大豆油脂的降解，米曲霉等微生物產(chǎn)生的脂肪酶能將全大豆中的油脂降解為甘油和脂肪酸，脂肪酸進(jìn)一步氧化降解成一些小分子酸，酸類物質(zhì)對(duì)醬油香氣具有一定的柔和作用[10，20]。美拉德反應(yīng)作為醬油風(fēng)味物質(zhì)形成的重要途徑之一，其反應(yīng)過程十分復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)物眾多，而且大豆脂質(zhì)的氧化能提供大量的羰基化合物，這些中間產(chǎn)物在美拉德反應(yīng)中必然存在相互作用，可能進(jìn)一步形成醬油的風(fēng)味成分。

3 結(jié)論

全大豆和脫脂大豆的主要成分差異是有機(jī)溶劑浸出的油脂類物質(zhì)，而釀制出醬油的風(fēng)味卻差異顯著，全大豆釀造醬油整體滋味協(xié)調(diào)，醇香、醬香濃郁，色澤棕紅亮，而脫脂大豆釀造醬油滋味一般，酸味較強(qiáng)，醇香和醬香較淡，色澤較深。

2種醬油共鑒定出香氣物質(zhì)47種，其中醇類化合物15種，酯類化合物12種，酸類化合物5種，酮類化合物5種，酚類化合物3種，醛類2種，吡咯類2種，其他類化合物3種。雖然全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油的揮發(fā)性風(fēng)味成分是相同的，但其含量存在較大差異，全大豆釀造醬油中除了醇類和醛類化合物外，酯類化合物、酸類化合物、酮類化合物、酚類化合物、吡咯類化合物和其他類化合物的相對(duì)含量均比脫脂大豆釀造醬油高。因此，在全大豆釀造醬油和脫脂大豆釀造醬油的對(duì)比研究中，大豆油脂類物質(zhì)是引起釀造醬油風(fēng)味成分差異的主要原因。

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