楊繼濤，楊 敏

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅 蘭州 730070）

籽瓜（Citrullus lanatusssp.vulgaris var.megakasperms Lin et Chao），葫蘆科，一年生蔓性草本，形狀與西瓜類似，多籽，含糖量低，因其習(xí)慣上以食用籽為主，故稱籽瓜[1-2]。籽瓜在我國(guó)種植面積廣泛，尤其在我國(guó)西北干旱地區(qū)為重要的經(jīng)濟(jì)作物[3]。由于籽瓜主要為籽用，長(zhǎng)久以來(lái)，在籽瓜主產(chǎn)區(qū)都是以取籽為主，作為加工炒食制品的原料，而瓜瓤和瓜皮則丟棄不用，丟棄的瓜瓤和瓜皮占總質(zhì)量的65%～70%，致使籽瓜利用率低，而且造成了嚴(yán)重的浪費(fèi)[4]。

果膠存在于植物細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)，一般從蘋果、柑橘等果皮中提取[5-8]。果膠在乳品工業(yè)、釀造業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，市場(chǎng)需求巨大[9-12]。果膠為多糖類大分子化合物，利用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取的報(bào)道較多，大多數(shù)工藝中，一般以水為提取溶劑，輔以微波、加熱、超聲等方法，而植物中大分子極性化合物，如雜多糖、色素、蛋白質(zhì)等，均會(huì)出現(xiàn)共提取的問(wèn)題，影響果膠產(chǎn)品的純度[13-15]。果膠純度一般用半乳糖醛酸含量來(lái)表示，含量越大表示純度越高[16]。本研究采用咔唑-硫酸比色法測(cè)定果膠中半乳糖醛酸含量，為了更好提高籽瓜皮中所提取果膠的純度，考察以水為提取溶劑條件下，提取溫度、提取時(shí)間和提取液pH值等因素對(duì)籽瓜皮中果膠提取的影響，并對(duì)提取條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，確定高純度果膠的最佳提取工藝參數(shù)，利用傅里葉變換紅外光譜對(duì)比分析了在優(yōu)化條件下所提取的籽瓜皮中果膠的純度，以期為籽瓜皮果膠的高效提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜：采自甘肅白銀平川；高純果膠（半乳糖醛酸含量76%）：鄭州天順食品添加劑有限公司；濃鹽酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、濃硫酸（分析純）：北京化工廠；D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技公司；咔唑（分析純）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（色譜純）：Aladdin化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003型精密電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市順華儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；FTS3000型傅立葉變換紅外光譜儀：美國(guó)Digilab公司；XFB-200型粉碎機(jī)：湖南中誠(chéng)制藥機(jī)械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 籽瓜皮中果膠的提取

籽瓜皮的預(yù)處理：選取新鮮無(wú)腐的籽瓜皮，洗凈后切成小塊，然后在沸水中加熱煮沸8 min，再用50 ℃熱水淋洗2～3次，以除盡籽瓜皮內(nèi)的酶，自然風(fēng)干，將風(fēng)干后的籽瓜皮粉碎過(guò)100目篩封裝備用。

果膠提?。悍Q取30.0 g上述處理好的籽瓜皮粉末，按一定的料液比加入蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，油浴恒溫一定時(shí)間提取果膠，趁熱過(guò)濾得濾液，再對(duì)殘?jiān)M(jìn)行相同條件的二次提取。集合濾液減壓濃縮至200 mL，加入體積比1∶3的無(wú)水乙醇沉析過(guò)夜，析出果膠后離心收集，放入干燥箱中60 ℃干燥12 h，稱質(zhì)量備用。

1.3.2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測(cè)定

采用咔唑-硫酸法測(cè)定籽瓜皮果膠中的半乳糖醛酸的含量[17]。

（1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的標(biāo)品溶液。各移取上述半乳糖醛酸溶液1～9 mL于10 mL容量瓶中，稀釋至10 mL，得到質(zhì)量濃度為10～90 μg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（2）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

移取不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于具塞試管中，在冰水浴冷卻下，緩慢加入5.5 mL濃硫酸，沸水浴中加熱15 min后，降至室溫，再加入0.15%咔唑0.5 mL，充分混合（以蒸餾水代替半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依上法同樣處理，作為對(duì)照空白）。室溫放置35 min后，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)530 nm處，分別測(cè)定其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中半乳糖醛酸的含量（x）為橫坐標(biāo)，制作半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）果膠半乳糖醛酸含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取籽瓜皮果膠樣品10 mg，配制成0.1%的果膠溶液，精確量取1 mL待測(cè)液，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定其吸光度值。通過(guò)上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算果膠中半乳糖醛酸的含量，其計(jì)算公式如下：

Y=A×V×N/W×100%

式中：Y為半乳糖醛酸含量，%；A為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測(cè)液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；W為果膠樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 果膠提取的單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以半乳糖醛酸含量為響應(yīng)值，分別研究提取溫度（73℃、78 ℃、83 ℃、88 ℃、93 ℃）、提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）、pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）和料液比（30∶1、27∶1、25∶1、23∶1、21∶1（g∶L））對(duì)籽瓜皮中所提取果膠的半乳糖醛酸含量的影響。

（2）Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、提取液pH值（C）為影響因素，以籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量（Y）為響應(yīng)值，確定籽瓜皮中果膠的最優(yōu)提取條件。因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 傅里葉變化紅外光譜分析

利用傅立葉變換紅外光譜儀，比對(duì)市售果膠樣品和最佳工藝條件下提取的籽瓜皮中果膠的紅外光譜。各準(zhǔn)確稱取10 mg的果膠樣品，60 ℃干燥6 h，粉碎研細(xì)后，KBr壓片，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，掃描時(shí)間0.5 min，掃描分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32。

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用咔唑-硫酸比色法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸在波長(zhǎng)530 nm處的吸光度值，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

由圖1可知，在0～90 μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.005 8x-0.008 6，擬合系數(shù)R2=0.999 1，表明半乳糖醛酸含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 籽瓜皮中果膠提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取溫度(A)、提取液pH值(B)、提取時(shí)間(C)和料液比(D)對(duì)果膠中半乳糖醛酸含量的影響Fig.2 Effects of extraction temperature (A),pH value (B),time (C) and solid-liquid ratio (D) on galacturonic acid content of pectin

由圖2可以看出，隨著提取溫度的升高，半乳糖醛酸含量顯著提高，在83 ℃時(shí)半乳糖醛酸含量達(dá)到最大值為69.5%，繼續(xù)升高溫度，半乳糖醛酸含量降低。這可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)使果膠發(fā)生降解，導(dǎo)致半乳糖醛酸含量減少。因此，選擇提取溫度為83 ℃較為理想。

提取液pH值在1.0～1.5，隨著pH值的增大，半乳糖醛酸含量提高。pH值＞1.5之后，半乳糖醛酸含量顯著降低，表明果膠半乳糖醛酸存在一個(gè)較低的pH范圍內(nèi)，較高的pH不利于果膠半乳糖醛酸提取。因此，選擇提取液pH值為1.5較為理想。

提取時(shí)間在30～120 min，半乳糖醛酸含量逐漸提高，提取時(shí)間＞120 min，半乳糖醛酸含量下降。可見(jiàn)，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使部分游離的果膠水解，造成果膠半乳糖醛酸含量降低。因此，選擇提取時(shí)間為120 min較為理想。

料液比在20∶1～30∶1（g∶L），半乳糖醛酸含量的變化不明顯，在料液比為23∶1（g∶L）時(shí)達(dá)到最大值69.3%，再繼續(xù)增大料液比，半乳糖醛酸含量開(kāi)始減小，因此，選擇提取料液比為23∶1（g∶L）較為理想。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

從單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，其中料液比因素對(duì)半乳糖醛酸的含量影響較小，固定料液比為23∶1（g∶L），以提取時(shí)間，提取溫度及提取液pH值為因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，其結(jié)果見(jiàn)表2，顯著性與方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface experiment

表3 回歸模型顯著性與方差分析Table 3 Variance analysis and significance tests of regression model

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，果膠半乳糖醛酸含量（Y）與各因素的回歸方程如下：

由表3看出，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬檢驗(yàn)的P值是0.085 0＞0.05，表明相對(duì)于純誤差失擬是不顯著的。擬合模型的R2=0.997 5，表明99.75%的變異來(lái)源于自變量。預(yù)測(cè)模型R2=0.994 2，表明試驗(yàn)值與對(duì)應(yīng)的模型預(yù)測(cè)值之間高度一致，由此可知模型擬合良好，可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

分析表3可知，各因素對(duì)果膠半乳糖醛酸含量影響排序?yàn)镃（pH值）＞B（溫度）＞A（時(shí)間）。其中對(duì)果膠半乳糖醛酸的含量影響極顯著的是B、C、AB、BC、A2、B2、C2，顯著的是AC。

2.3.2 單因素交互作用

考察各因素之間相互關(guān)系對(duì)籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量的影響，通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3A可以看出，提取溫度在低水平時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間能提高果膠半乳糖醛酸含量，提取溫度在高水平時(shí)，加熱較短的時(shí)間就能獲得較高的半乳糖醛酸含量，其曲面較為平緩。

由圖3B可以看出，提取溫度和提取液pH值兩個(gè)因素間有較強(qiáng)的交互作用，其曲面較陡，提取溫度為78～88 ℃及提取液pH值為1.0～1.5 時(shí)，果膠半乳糖醛酸含量達(dá)到較高值，當(dāng)二者水平過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使果膠半乳糖醛酸含量下降，提取液pH值和提取溫度應(yīng)有各自適宜的水平范圍。

由圖3C可以看出，提取時(shí)間和提取液pH值與半乳糖醛酸含量呈拋物線關(guān)系，曲面也較為陡，在一定范圍內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)和pH值升高，半乳糖醛酸含量增大，達(dá)到最大值后，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間和提高提取液pH值，半乳糖醛酸含量呈下降趨勢(shì)。

圖3 提取溫度、提取時(shí)間和提取液pH值的交互作用對(duì)果膠中半乳糖醛酸含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interactions between extraction time,temperature and pH value on galacturonic acid content of pectin

2.3.3 模型驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert 8.0確定的最佳提取工藝為提取溫度88 ℃，提取時(shí)間147 min，提取液pH值為1.64，在此條件下，果膠中半乳糖醛酸含量的的預(yù)測(cè)值為78.10%?？紤]到操作的方便性，確定的最佳工藝條件為提取溫度88 ℃，提取時(shí)間150 min，提取液pH值為1.6，在此條件下，果膠中半乳糖醛酸含量的的預(yù)測(cè)值78.03%。采用上述條件進(jìn)行模型驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)5次，所得籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量平均值為76.65%，與理論預(yù)測(cè)值擬合較好，可見(jiàn)該模型能較好地模擬與預(yù)測(cè)提取工藝條件對(duì)果膠中半乳糖醛酸含量的影響。

2.4 紅外光譜比對(duì)分析

圖4 不同果膠的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of different pectin

由圖4可以看出，由于果膠為多糖類化合物，其中含有大量的羥基，其中在波數(shù)范圍3 700～3 000 cm-1出現(xiàn)的寬峰為羥基O-H振動(dòng)的結(jié)果；果膠中半乳糖醛酸甲酯的部位在波數(shù)2 900～2 700 cm-1之間產(chǎn)生O-CH3的伸縮振動(dòng)；波數(shù)1 627 cm-1和1 743 cm-1處分別為羧基官能團(tuán)和酯化羧基官能團(tuán)中C=O的吸收峰[18]。經(jīng)比較，采用優(yōu)化工藝從籽瓜皮中所提取果膠與商售高純果膠產(chǎn)品紅外圖譜峰型與豐度較一致，產(chǎn)品對(duì)比具有較好的相似性。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法，優(yōu)化了籽瓜皮中果膠提取工藝，即水溶劑條件下，提取溫度88 ℃，提取時(shí)間150 min，提取液pH值為1.6，料液比為23∶1（g∶L）。該條件下提取的果膠半乳糖醛酸含量較高，均值為76.65%，與理論預(yù)測(cè)值（78.03%）擬合良好，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性好。所提取果膠符合市場(chǎng)規(guī)定的半乳糖醛酸含量≥65%的標(biāo)準(zhǔn)[19]。利用傅里葉變換紅外光譜比對(duì)分析表明，市售高純果膠產(chǎn)品與本研究所提取的果膠紅外光譜圖吻合度高，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可運(yùn)用于實(shí)踐。

[1]程瑛琨，孟慶繁，陳亞光，等.籽瓜多種營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（7）：169-171.

[2]吳霞明，趙金蓮.籽瓜中微量元素與維生素含量的分析[J].中國(guó)釀造，2007，26（11）：65-67.

[3]梁 琪，鄭善強(qiáng).甘肅省不同產(chǎn)地籽瓜瓤皮成分分析[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（1）：79-83.

[4]田林森.籽瓜綜合加工[J].食品科學(xué)，1997，18（6）：65-66.

[5]賈艷萍，何愛(ài)民.微波法萃取橘皮中果膠的研究[J].中國(guó)釀造，2006，25（3）：48-51.

[6]文奮武，楊孝樸.甜菜渣提取果膠的研究：酸法萃取，乙醇沉淀工藝[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1996，32（4）：142-148.

[7]牛麗影，李大婧，劉春泉.響應(yīng)面法優(yōu)化香櫞果膠提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2013，34（23）：219-222.

[8]WAI W W,ALKARKHI A F M,EASA A M.Comparing biosorbent ability of modified citrus and durian rind pectin[J].Carbohyd polym,2010,79(3):584-589.

[9]董 丹，關(guān)統(tǒng)偉，雷 激，等.檸檬皮渣果膠提取預(yù)處理工藝研究[J].中國(guó)釀造，2014，33（12）：80-84.

[10]KIM Y,WICKER L.Charge domain of modified pectins influence interaction with acidified caseins[J].Food Hydrocolloid,2011,25(3):419-425.

[11]BEYER M,REICHERT J,HEURICH E,et al.Pectin,alginate and gum arabic polymers reduce citric acid erosion effects on human enamel[J].Dent Mater,2010,26(9):831-839.

[12]RAKHSHAEE R,PANAHANDEH M.Stabilization of a magnetic nano-adsorbent by extracted pectin to remove methylene blue from aqueous solution:a comparative studying between two kinds of crosslikened pectin[J].J Hazard Mater,2011,189(1):158-166.

[13]劉煥云，李慧荔，頓博影.微波加熱法提取柚果皮果膠的工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（8）：302-304.

[14]章 凱，黃國(guó)林.微波萃取技術(shù)及其在果膠提取中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造，2009，28（4）：9-13.

[15]李建鳳，任 磊，王 真，等.響應(yīng)曲面法用于超聲波提取檸檬皮渣果膠研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（4）：267-269.

[16]余繼宏，朱炯波，聶 琴.天仙果果膠提取條件及含量測(cè)定[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2007（3）：6-8.

[17]張小玲.果膠的咔唑硫酸分光光度測(cè)定法研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（1）：75-78.

[18]馮 靜，梁瑞紅，劉成梅，等.菠蘿皮果膠的提取及結(jié)構(gòu)組成研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（11）：241-243.

[19]趙 利，王 杉.果膠的制備及其在食品工業(yè)的應(yīng)用綜述[J].食品科技，1999（5）：32-34.