劉承軍 (山東省聊城市動(dòng)物醫(yī)院 山東聊城252000)

禽鏈球菌在自然界和飼養(yǎng)環(huán)境中普遍存在，是大部分禽類腸道正常菌叢的組成部分。因此，一般認(rèn)為禽鏈球菌為非致病菌，其感染多為繼發(fā)性感染，未能引起禽類養(yǎng)殖者和獸醫(yī)工作者的關(guān)注與重視。然而，隨著禽類集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，鏈球菌病在我國(guó)部分地區(qū)發(fā)病率逐年提高，且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過(guò)不同接種途徑，研究鏈球菌對(duì)雛鴨致病性的差異，為更好防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 設(shè)備

輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2135，德國(guó)萊卡公司）、一次性切片刀（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）、電熱干燥箱（D-102，武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）、漂烘處理儀（ZMN-6802，中國(guó)常州利華電子公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（公私合營(yíng)國(guó)光醫(yī)化儀器廠制造）、潔凈工作臺(tái)（CJ-1B，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）、自動(dòng)磨刀機(jī)（ZMD-Ⅱ，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）、高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)（日本Nikon公司產(chǎn)品）、Nikon80i生物光學(xué)顯微鏡。

1.1.2 毒株

鴨源鏈球菌，聊城市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

1日齡櫻桃谷雛鴨（購(gòu)自聊城市長(zhǎng)順?lè)N鴨場(chǎng)），飼喂肉用仔鴨前期配合飼料（購(gòu)自聊城市五征飼料廠），飲水正常，飼養(yǎng)9日后，經(jīng)血液檢查無(wú)細(xì)菌感染后，隨機(jī)分為5組，每組6羽，分別為腹腔組、皮下組、腳蹼組、顱內(nèi)組和對(duì)照組。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的復(fù)蘇和純化

供試菌株接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，純培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 培養(yǎng)特性和細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

無(wú)菌操作挑取純化的菌液接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落作革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

1.2.3 感染菌液的制備和濃度測(cè)定

挑取TSA培養(yǎng)基上經(jīng)純化的單個(gè)菌落，接種于15mLTSB液體培養(yǎng)基，搖勻純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18h，利用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算制備菌液中活菌數(shù)為1.5×10CFU/mL。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

4個(gè)試驗(yàn)組設(shè)為腹腔組、皮下組、腳蹼組和顱內(nèi)組，分別采用腹腔接種、皮下接種、腳蹼接種及顱內(nèi)接種的接種方式，接種注射劑量為0.2mL/只，對(duì)照組不作處理。

感染后每天觀察各組鴨臨床癥狀，記錄發(fā)病和死亡時(shí)間及數(shù)量；定期采集血液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查：死亡鴨及時(shí)進(jìn)行尸體剖檢，剖檢時(shí)觀察記錄各組織及臟器病變，取肝臟、脾臟、腦、心臟及心包膜、肺、腎臟、法氏囊、胸腺和十二指腸等組織器官，用中性福爾馬林固定。其他各試驗(yàn)組未死亡鴨和對(duì)照組繼續(xù)正常飼養(yǎng)，觀察記錄臨床癥狀，14天后全部宰殺、剖檢，剖檢時(shí)觀察記錄各組織及臟器病變，取肝臟、脾臟、腦、心臟及心包膜、肺、腎臟、法氏囊、胸腺、十二指腸等組織器官，用中性福爾馬林固定，并分組編號(hào)。

1.2.5 病原菌的分離與鑒定

解剖死亡病鴨，取出病變的肝臟涂片，作革蘭氏染色。并接種于TSA血清平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落作革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

1.2.6 病理切片制作和病理組織學(xué)觀察

各組織器官用中性福爾馬林固定2周后，按常規(guī)方法制作石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)H.E染色，光鏡下觀察記錄病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

對(duì)臨床死亡鴨的腦組織和心血進(jìn)行細(xì)菌分離，分離菌在TSA血清板上長(zhǎng)成表面濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落，直徑約1mm。革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，單個(gè)、成對(duì)或成短鏈狀排列，形態(tài)與接種菌一致。

2.2 發(fā)病情況及臨床癥狀

頸部皮下組：雛鴨接種后第2天開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀,精神不振,眼瞼腫脹，頭部羽毛蓬松,食欲下降，黃色稀糞,病程持續(xù)7天后精神有所好轉(zhuǎn),但雛鴨眼部分泌物逐漸增多,頸部皮毛較稀,生長(zhǎng)緩慢,發(fā)病率100%(6/6),于接種后第3天死亡第一羽，死亡4羽。

腹腔組：雛鴨接種后2天精神不振,頭部羽毛蓬松,眼瞼腫脹，喜臥惡動(dòng),排黃色稀糞，發(fā)病率100%(6/6)，死亡2羽。第13天精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn),第15天精神狀態(tài)和食欲正常,生長(zhǎng)緩慢。

腳蹼組：雛鴨接種后第3天精神不振,喜臥惡動(dòng),病程持續(xù)8天后有所好轉(zhuǎn),但有雛鴨腳蹼上長(zhǎng)了數(shù)個(gè)米粒大小的腫塊,發(fā)病率100%(6/6),死亡3羽。

顱內(nèi)組：接種當(dāng)天死亡1羽，懷疑為接種顱內(nèi)操作致死，其他接種3天精神不振，眼瞼腫脹，排黃綠稀糞，發(fā)病率100%(6/6),死亡3羽。

空白對(duì)照組：6羽雛鴨精神狀態(tài)和食欲正常,好動(dòng),羽毛光滑,生長(zhǎng)速度較快。

2.3 發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)（見(jiàn)下表）

表1 不同途徑感染后雛鴨的發(fā)病率與死亡率

表2 不同途徑感染后雛鴨的剖檢病理變化統(tǒng)計(jì)

表3 不同途徑感染后雛鴨的鏡檢病理變化統(tǒng)計(jì)

3 討論

在4種不同接種途徑對(duì)雛鴨致病性試驗(yàn)中，選用相對(duì)較高的菌液濃度，人工復(fù)制病變比較典型。這與鏈球菌在部分地區(qū)發(fā)病率較高相吻合，在實(shí)際雛鴨養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)引起對(duì)禽鏈球菌病的重視。

經(jīng)頸部皮下接種感染雛鴨的病變最為嚴(yán)重，死亡率最高。病變特征最為明顯，表現(xiàn)為脾臟腫大，心內(nèi)膜炎，肝臟、脾臟和腎臟有局灶性壞死，腦膜炎等典型癥狀。腹腔接種途徑和腳蹼接種途徑人工復(fù)制病變也很明顯，但顱內(nèi)接種途徑致病性最弱。頸部皮下接種表現(xiàn)出的高致病性，與這種接種途徑比較接近于雛鴨的胸腺有關(guān)，胸腺在機(jī)體中作為免疫中樞器官，在雛鴨早期個(gè)體免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用，鏈球菌最先在胸腺附近大量增殖，嚴(yán)重降低了機(jī)體的免疫能力，加劇了病變的進(jìn)程，從而造成頸部皮下組急性死亡，死亡率最高。腹腔接種途徑的致病性較高在于，直接接種腹腔內(nèi)，突破皮膚和黏膜屏障，直接在腹腔臟器大量增殖，對(duì)脾臟、肝臟和腎臟致病力較強(qiáng)。腳蹼組有如此高的致病性，反映出在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，由于腳蹼的外傷，可能造成鏈球菌病的感染，從而造成鏈球菌病的暴發(fā)，應(yīng)當(dāng)引起特別注意。腹腔組和腳蹼組結(jié)果提示在養(yǎng)殖過(guò)程中注射不合格抗體或注射藥物操作不當(dāng)是鏈球菌感染的重要途徑之一。顱內(nèi)組作為接毒途徑致病力較弱，操作較困難，不適合作為人工復(fù)制鏈球菌感染雛鴨實(shí)驗(yàn)的最佳途徑，后續(xù)研究應(yīng)避免使用這種接毒途徑。