張賽奇，王 米，雷 娜，楊銳樂， 薛飛群

(中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所/中國農(nóng)業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室/農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學病重點實驗室,上海 200241)

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中藥對豬源大腸桿菌O8體外抑菌試驗研究1*

張賽奇，王 米*，雷 娜，楊銳樂， 薛飛群*

(中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所/中國農(nóng)業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室/農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學病重點實驗室,上海 200241)

為了探討豬源大腸桿菌O8對黃連等10種中藥的體外敏感性，采用瓊脂擴散法和微量二倍稀釋法對10種中藥水提物進行體外抑菌試驗，測定抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明：黃連對大腸桿菌O8呈高度敏感，抑菌圈直徑為21.3 mm，其MIC值為7.813 mg/mL，抑菌效果最好；黃芩、五倍子呈中度敏感，其MIC值為31.25 mg/mL；而苦參不敏感，其MIC值為500 mg/mL，抑菌效果差。

中藥；豬源大腸桿菌O8； 體外抑菌試驗；最小抑菌濃度

大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要病原，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌( ETEC) 是最主要的致病菌，病原以O(shè)8、O101等大腸桿菌較為常見，對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大[1]。大腸桿菌的血清型比較多，引起的疾病目前無理想的疫苗來預(yù)防，臨床多采用抗菌藥物進行治療，但由于抗菌藥物持續(xù)地和不恰當?shù)厥褂?，?dǎo)致大腸桿菌耐藥機制不斷變遷，耐藥性不斷提高，同時這些藥物大量使用造成畜產(chǎn)品中藥物殘留嚴重，從而威脅人類健康。如何選用對大腸桿菌有較好抑制作用的藥物是當今獸醫(yī)臨床的主要任務(wù)之一。

中獸醫(yī)理論認為，中藥具有提高機體免疫力、抗菌、中和降解毒素和促進腸黏膜愈合等作用。同時，中藥主要通過調(diào)整機體功能狀態(tài)來實現(xiàn)抗菌作用，而西藥側(cè)重于藥物與微生物間的作用[2]。中藥的這種獨特優(yōu)勢為人們提供了新的研究內(nèi)容。雖然目前市場上有很多純中藥獸藥產(chǎn)品，但對其基礎(chǔ)研究仍比較薄弱。近年來，有關(guān)中藥對病原菌的體外抑菌效果陸續(xù)有報道，但一般只對中藥的抑菌屬性進行定性分析。本研究旨在對10種單味中藥對豬源大腸桿菌O8的體外抑菌活性進行定性和定量研究，以便為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中藥黃柏、苦參、生大黃、連翹、白頭翁、五倍子、秦皮、金銀花、黃連、黃芩均購于上海安德大藥房，所有藥物經(jīng)鑒定均符合生藥質(zhì)量標準。豬源致病性大腸桿菌O8，型號C83901，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物貯藏中心。培養(yǎng)基：①普通肉湯培養(yǎng)基: 牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，純化水至1 000 mL， pH 7.2～7.4; ②普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，純化水至1 000 mL，pH 7.2～7.4。配制后高壓滅菌后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器：R 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司生產(chǎn);ESCO生物安全柜，新加坡Esco 科技有限公司生產(chǎn)；96微孔板，丹麥Nune 公司產(chǎn)品；微量移液器，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；高速離心機，ThermoFisher Scientific公司生產(chǎn)。

1.2 菌液培養(yǎng)

試驗前將菌種接種到肉湯培養(yǎng)基復(fù)活備用。將復(fù)活的供試菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待菌種復(fù)壯后使用。挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h， 連續(xù)培養(yǎng) 3代，以恢復(fù)其活力。用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，按照麥氏比濁法使其濁度達1×105～1×109CFU/mL，備用。

1.3 藥物制備

10味中藥分別加適量的水浸潤后，加10倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煮1 h，前后共煮兩次。合并兩次藥液，過濾，離心沉淀、最后濃縮至含量為1 mL相當于原生藥1 g。分裝，調(diào)整pH至7.3，流通蒸氣滅菌20 min，4 ℃保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 瓊脂擴散法 參考文獻[3]將之前培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液稀釋成107cfu/mL，分別取1 mL于培養(yǎng)皿內(nèi)，再加入20 mL冷卻至45 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻，完全冷卻后用直徑6 mm的打孔器均勻打孔，每板4孔，去除孔內(nèi)瓊脂并適當封閉孔底。每孔加入100 μL中藥提取液，以滿而不溢為宜并做好標記。置4 ℃冰箱中作用1 h后取出，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量各抑菌圈直徑，判斷各種藥液對大腸桿菌的抑菌效果。無菌水作為對照，每個處理設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果判定標準： 抑菌圈直徑>20 mm為高敏,抑菌圈直徑15～20 mm為中敏,抑菌圈直徑10～15 mm為低敏，抑菌圈直徑<10 mm為不敏感。

1.4.2 微量2倍稀釋法(MIC試驗) 參考文獻[4]將各中藥提取液用2倍法配成系列濃度的供試藥液，分別加入96孔板的第2孔至第11孔，每孔100 μL，再將之前培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液稀釋成107cfu/mL，每孔加入100 μL，至此96孔板每孔體積為200 μL(為避免培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)不均造成的影響，第1孔和第12孔不加藥，僅加入200 μL無菌水)，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每孔再加入40 mL濃度為0.2 mg/μL的碘硝基四唑紫指示劑，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后取出觀察每孔細菌生長情況，其中渾濁并帶有粉色沉淀的說明有細菌生長，澄清透明的則說明在該孔相應(yīng)的藥物濃度下對細菌生長代謝有抑制作用，最小抑菌濃度值(MIC值)即能抑制細菌生長的最低藥物濃度。無菌水作為對照，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試中藥敏感性測定結(jié)果

從表1知，各中藥對大腸桿菌的敏感性不同，其中黃連對豬源大腸桿菌O8的敏感性最強，其抑菌圈直徑為21.3 mm；黃芩、黃柏和五倍子為中度敏感，其抑菌圈直徑分別為17.0 mm、16.7 mm和17.3 mm；連翹、金銀花、大黃、白頭翁和秦皮對大腸桿菌具有較低的敏感性，抑菌圈直徑分別為10.3 mm、13.3 mm、14.7 mm、12.1 mm和14.6 mm；而苦參則對大腸桿菌沒有敏感性，沒有呈現(xiàn)明顯的抑菌圈。

表1 不同中藥的體外抑菌效果

注：抑菌圈直徑為3次平均值，抑菌圈大小包括孔徑(6 mm);“-”表示未檢出。

Notes: The inhibitory zone diameter was the average values of 3 tests, and the size of inhibitory zone included the bore diameter(6 mm) ；“-” means the inhibitory zone could not be obtained.

2.2 MIC的測定結(jié)果

從表2可以看出，各中藥對大腸桿菌均具有一定的抑菌效果，各中藥的MIC 值有一定的差異，其中黃連、黃芩和五倍子的抑菌效果較強，其MIC值分別為7.82、15.63和15.63 mg/mL，明顯高于其他中藥；其次為黃柏、大黃、金銀花、秦皮等，這些中藥對大腸桿菌的MIC值沒有超過125 mg/mL，也表現(xiàn)出較好的抑菌效果；依次為白頭翁、連翹，這兩味中藥也呈現(xiàn)出一定的抑菌效果；而苦參的抑菌效果較差，MIC值已超過250 mg/mL。

表2 各中藥最低抑菌濃度(MIC)試驗結(jié)果

注：“-”表示無細菌生長；“+”表示有細菌生長，隨著“+”數(shù)增加菌落長勢增強。

Notes:“-” means no bacterial growth;“+” means bacterial growth, and with the increase of “+” the colonies grow better.

3 討 論

研究中藥對病原菌的體外抑菌活性試驗方法很多,一般采用的方法有管碟法、固體培養(yǎng)基法、紙片抑菌法、平皿稀釋法以及瓊脂擴散法等，它們通常只用于對中藥的抑菌活性作定性研究，定量分析常用二倍稀釋法[5]。本試驗中，筆者采用瓊脂擴散法和二倍稀釋法兩種方法，同時對傳統(tǒng)方法進行了稍加改進。結(jié)果表明，這2種方法具有一定的相關(guān)性，同時也存在一定的差異性。

本次試驗所取中藥分為清熱藥、解表藥、攻下藥和收澀藥等[6]。10種中草藥體外抑菌試驗表明，在中藥濃度為1 g/mL時，黃連對豬大腸桿菌呈高度敏感，最小抑菌濃度為7.82 mg/mL，表現(xiàn)出很好的抑菌效果，這與李福娟[7]報道的相一致；其次為黃柏、大黃、金銀花等，其對豬大腸桿菌呈中度敏感，最小抑菌濃度沒有超過125 mg/mL，也表現(xiàn)出一定的抑菌效果，不過岳云升等[8]發(fā)現(xiàn)大黃對大腸桿菌幾乎無抑制作用；苦參對豬大腸桿菌不敏感，其最小抑菌濃度也已超過250 mg/mL。本試驗結(jié)果與有關(guān)文獻報導(dǎo)存在一定的差異，主要原因可能是之前的研究與本研究相比，所用大腸桿菌來源不同，其致病力不同，本研究所用的菌種為豬源致病性大腸桿菌。

總之，本試驗研究表明，除苦參外，9種中藥對豬源大腸桿菌O8都有不同程度的抑制作用，該研究結(jié)果對臨床應(yīng)用中藥防治豬大腸桿菌病具有一定的指導(dǎo)意義；而根據(jù)中藥的體外抑菌效果及中獸醫(yī)理論組方，篩選效果良好的抗菌中藥復(fù)方需要進一步的研究。

[1] 張鵬飛．中西醫(yī)結(jié)合治療仔豬黃白痢病[J]．畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27(6)：111-113．

[2] 王曉暉，劉亭岐，陳 波，等．14種中藥及其組方對臨床常見致病菌的抑菌作用．畜牧與獸醫(yī)，2009，41(8)：74-76．

[3] Cole M. Key antifungal, antibacterial and anti-insect assays-a critical review[J]. Biochemical Systematics Ecol,1994,22(8):837-856.

[4] Eloff J. A sensitive and quick microplate method to determine concentration of plants extracts for bacteria[J].Planta Medica,1998,64(8):711.

[5] 陳 莉，朱鳳靜，張春枝． 30種中藥水提取物的體外抗菌活性試驗[J].大連輕工業(yè)學院學報，2005,24(4)：269-271．

[6] 唐志書，李 敏．中藥學筆記圖解[M]．北京：化學工業(yè)出版社，2009．

[7] 李福娟，石學魁，張曉莉，等．苦參、黃連及其配伍的體外抑菌研究．牡丹江醫(yī)學院學報，2010，31(3)：17-19．

[8] 岳云升，李仲興，王秀華，等．用新方法對308株臨床菌株抗菌活性研究．航空航天醫(yī)藥，2004，15(1)：16-18．

Antibacterial Sensitivity of Chinese Herbal Medicine against SwineEscherichiacoliO8in Vitro

ZHANG Sai-qi, WANG Mi*,LEI Na, YANG Rui-le, XUE Fei-qun

(KeyLaboratoryofAnimalParasitologyofMinistryofAgriculture,KeyOpenLaboratoryofVeterinaryDrugSafetyEvaluationandResiduesResearchofChineseAcademyofAgriculturalSciences,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,Shanghai200241,China)

Inhibitory effect of 10 kinds of Chinese herbal medicine was explored for swine Escherichia coli O8(E.coli)in vitro by using the agar plate diffusion method and trace double dilution method. The diameter of the inhibitory zone and minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. The results showed thatCoptischinensiswas highly sensitive to swineE.coli,the inhibitory zone diameter was 21.3 mm,and its MIC forE.coliO8was 7.813 mg/mL, indicating best inhibitory effect;Scutellariabaicalensis,GallaChinensiswere moderately sensitive with a MIC of 31.25 mg/mL; However,Sophoraflavessentiswas insensitive with MIC to be 500mg/ml, displaying a poor inhibitory effect.

Chinese herbal medicine; swineEscherichiacoliO8; bacteriostatic test in vitro ; minimum inhibitory concentration

2015-02-02

2015-04-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303040-08)；863計劃課題(2011AA2114)；國家自然科學基金(31272607)

張賽奇(1990-) ，男，河南漯河人，碩士，研究方向為中獸藥。E-mail：zhangsaiqi0104@163.com

*[通訊作者] 王 米(1975-)，男，四川綿陽人，博士，研究方向：中獸醫(yī)與中西獸醫(yī)結(jié)合。E-mail:wangmi@shvri.ac.cn; 薛飛群(1956-) ，男，甘肅天水人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為新獸藥研究與開發(fā)。E-mail:feiqun@ gmail.com

S811.6

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1005-5228(2015)08-0062-04