王金海，杜正高，鄭 羽，孔 瑩，洪 輝，邱 倩

（1.天津工業(yè)大學(xué) 電子與信息工程學(xué)院，天津300387；2.天津市醫(yī)學(xué)電子診療技術(shù)工程中心，天津300387）

低強度工頻磁場對腦片海馬區(qū)sEPSC發(fā)放特性的影響

王金海1，2，杜正高1，鄭 羽1，2，孔 瑩1，洪 輝1，邱 倩1

（1.天津工業(yè)大學(xué) 電子與信息工程學(xué)院，天津300387；2.天津市醫(yī)學(xué)電子診療技術(shù)工程中心，天津300387）

為研究磁場對腦片海馬區(qū)自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSC）的生物刺激作用，利用實際測量、數(shù)學(xué)建模和Comsol軟件對典型磁刺激裝置進(jìn)行建模與仿真，確定磁場暴露區(qū)的磁場強度和分布特性，并采用膜片鉗實驗對磁場刺激條件下大鼠離體腦片海馬區(qū)sEPSC進(jìn)行了研究.結(jié)果表明：磁場強度從刺激器舌面處到腦片區(qū)衰減125倍左右，且磁場進(jìn)入溶液后分布更加均勻；磁場強度越高，sEPSC的幅值和頻率越低，當(dāng)磁場強度達(dá)到2 mT時，神經(jīng)元sEPSC的幅值、頻率、半波長、上升時間和衰減時間顯著下降，說明隨磁場磁劑量增加，磁場抑制sEPSC的發(fā)放.

工頻磁暴露；磁場強度；分布特性；腦片海馬區(qū)；sEPSC；發(fā)放特性

隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展和人民生活水平的迅速提高，電力的廣泛應(yīng)用不可避免地引起越來越嚴(yán)重的電磁污染.近年來，人們開始關(guān)心這些彌散于我們周圍的電磁場會對生物體尤其是人類產(chǎn)生何種影響，對電磁場生物效應(yīng)的研究得到了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注.有研究表明，利用工頻磁場對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行暴露輻射，結(jié)果顯示人體的學(xué)習(xí)和預(yù)測能力出現(xiàn)下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象[1]；且有報道顯示，工頻電磁場影響大鼠的空間記憶力[2]和小雞的迂回學(xué)習(xí)能力[3].海馬區(qū)是神經(jīng)系統(tǒng)中主管學(xué)習(xí)和記憶的重要區(qū)域[4]，例如空間記憶、工作記憶和聯(lián)系記憶等，臨床新生兒的雙側(cè)海馬損傷會造成嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙[5]；海馬區(qū)還與一些神經(jīng)疾病有關(guān)，報道顯示其是阿爾茲海默病、癲癇等精神疾病主要的病變位置[6-7].也有報道顯示，30 mT恒定磁場能夠明顯延長海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的平均存活時間，且平均存活時間是對照組的一倍以上[8].

磁場作為一種物理因素，對運動的帶電物質(zhì)有洛倫茲力的作用.工頻磁場刺激是否對細(xì)胞間的帶電粒子有磁場導(dǎo)向移動作用，從而影響到海馬區(qū)神經(jīng)元sEPSC的電生理學(xué)特性？另外，研究低強度工頻磁場對海馬區(qū)腦片影響的報道也很少見.基于此，本文提出一種精確計算工頻磁場作用于腦片區(qū)的磁劑量及其分布特性的研究方案，分析從磁場源到腦片區(qū)的磁劑量和分布特性，并討論在該劑量下工頻磁場對大鼠海馬區(qū)sEPSC發(fā)放特性的影響，為揭示工頻磁場在海馬區(qū)的生物效應(yīng)奠定一定的理論和實驗基礎(chǔ).

1 磁場刺激器建模仿真

sEPSC發(fā)放特性是衡量大腦海馬組織功能強弱的一個重要指標(biāo)，sEPSC的發(fā)放反映海馬神經(jīng)元功能是否正常.通過上文可知，工頻磁場對中樞神經(jīng)及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞具有較大的影響.因此，精確計算作用在腦片上的工頻磁場磁劑量對sEPSC的檢測具有重要的意義.本節(jié)將從實際測量、數(shù)學(xué)建模及Comsol仿真3個方面對腦片區(qū)磁場強度進(jìn)行建模仿真，考察腦片區(qū)的磁場強度和分布特性，保證腦片放置在暴磁區(qū)的最佳刺激位置，并從微觀上定量確定磁場特性，為后續(xù)采用膜片鉗技術(shù)分析sEPSC的發(fā)放特性奠定基礎(chǔ).

1.1 磁場實際測量

本實驗自制磁場刺激器，磁路示例及等效電路如圖1所示.

圖1 實際工頻磁路示例及其等效電路Fig.1 Actual circuit and equivalent cicuit

磁路由馬蹄形硅鋼鐵芯載體、培養(yǎng)皿中溶液、鐵芯和培養(yǎng)皿間的空氣3段材料組成.培養(yǎng)皿玻璃介質(zhì)相應(yīng)參數(shù)與空氣相似，且所占空間很小，基本不影響磁場分布.其具體尺度參數(shù)為:鐵芯采用冷軋硅鋼片，厚2 cm，寬4 cm；線圈由直徑0.8 mm漆包銅線繞制，匝數(shù)為310匝，舌面積為8 cm2；培養(yǎng)皿為玻璃材質(zhì)，外壁和底部厚度均為1 mm，培養(yǎng)皿中裝有人工腦脊液（arificial cerebrospinal fluid，ACSF）[9].具體材料參數(shù)如表1所示.自制圓形線圈外接50 Hz交流穩(wěn)壓電源，可產(chǎn)生0～100 mT交變磁場，通過改變線圈中電流大小，可以調(diào)節(jié)線圈產(chǎn)生的磁場強度.

表1 材料參數(shù)Tab.1 Material parameters

在實際應(yīng)用工頻磁場對腦片區(qū)進(jìn)行磁場刺激時，首先需要通過PF-035型數(shù)字特斯拉計測得暴磁區(qū)即培養(yǎng)皿處的磁場強度，和實驗所需磁場強度進(jìn)行對比，然后通過調(diào)節(jié)線圈輸入電流大小，得到實驗所需磁場刺激強度.當(dāng)線圈中輸入電流分別為0.21、0.32和0.56 A時，測得中心暴露區(qū)的磁場大小為0.5、1和2 mT；且通過多點測量證實，在中心暴露區(qū)磁場分布基本均勻，滿足實驗要求.但是，在進(jìn)行多組試驗時，由于每組實驗所需的磁場刺激強度是不相同的，通過不斷對比磁場強度和調(diào)節(jié)線圈電流大小來得到所需磁場強度的方法不夠嚴(yán)謹(jǐn)，既耗費人力又浪費大量時間.因此，本文嘗試采用數(shù)學(xué)建模的方法，建立線圈電流強度與暴磁區(qū)磁場強度之間的關(guān)系式，通過確定輸入電流的強度，使得暴磁區(qū)即培養(yǎng)皿處能夠獲得所需的磁場強度.

1.2 數(shù)學(xué)建模

針對如圖1所示的磁刺激器，假設(shè)磁性材料內(nèi)磁感應(yīng)強度是均勻的，其值等于平均半徑處的磁感應(yīng)強度.設(shè)磁路平均長度為L，截面積為A，磁導(dǎo)率為μ，若線圈為N匝，有電流I，則外加磁動勢為Vm.具體參數(shù)為:鐵芯磁路長L1=220mm、鐵芯和培養(yǎng)皿頂部空氣磁路長L2=8mm、培養(yǎng)皿中溶液磁路長L3=32 mm；培養(yǎng)皿、鐵芯舌面積和空氣截面積分別為A1=7.52π mm2、A2=20×40 mm2、A2.由于培養(yǎng)皿和鐵芯之間的縫隙只有4 mm的距離，因此，鐵芯中磁感線設(shè)定都通過培養(yǎng)皿，這里設(shè)定空氣截面積和鐵芯舌面積相同.

根據(jù)磁路的計算原理，外加磁動勢Vm為:

磁性材料內(nèi)的磁通為:

如果磁路由n段組成，則:

式中:Φi為第i段的磁通；Rmi為第i段的磁阻，磁阻計算如下:

式中:R1=L1/u1A2；R2=（L2+L2′）/u2A2；R3=L3/u3A1；L1、L2+L2′、L3分別為鐵芯、空氣間隙和培養(yǎng)皿溶液中的磁路長度；u1、u2和u3分別為鐵芯、空氣、溶液中的磁導(dǎo)率；A2和A1分別為鐵芯（空氣）和溶液的截面積；R1、R2和R3分別為鐵芯、空氣和溶液中的磁阻.

由式（1）—（4）得培養(yǎng)皿中磁場強度（B）計算公式為:

根據(jù)式（5）計算可知，當(dāng)線圈中分別通入0.083、0.85和1.65 A的電流時，空氣間隙中磁場強度為0.5、1和2 mT.

通過數(shù)學(xué)建模，可以很快獲得實驗所需的暴磁區(qū)磁場強度.但是，該數(shù)學(xué)模型是以模型中的幾何中心線為磁路的，和實際磁路相差明顯；模型中沒有考慮溶液的濃度、離子密度、電導(dǎo)率等參數(shù)，建模得到的結(jié)果和實際測量有一定誤差.另一方面，實際測量中，由于特斯拉計精確度和靈敏度的限制以及空間上具體測量的難度，磁場分布的均勻性很難測量，數(shù)學(xué)建模也很難精確地確定磁場分布的情況，而磁場對腦片的刺激是整個區(qū)域的刺激，對于磁場均勻性需做進(jìn)一步研究.因此，本文采用Comsol軟件進(jìn)行進(jìn)一步建模分析.

1.3 Comsol建模仿真

Comsol Multiphysics是一款強大的有限元法分析軟件.研究者可以根據(jù)實際情況選擇不同的仿真環(huán)境和變量值，在結(jié)果中可清晰地看到物理場的分布情況.本文所研究的離體腦片及細(xì)胞的磁場輻射劑量在幾個mT范圍內(nèi)，在磁場刺激的時間段內(nèi)，溶液的溫度熱效應(yīng)忽略不計.在磁場刺激的過程中，腦片存活的環(huán)境是人工腦脊液.人工腦脊液和空氣的區(qū)別在于前者介質(zhì)為弱導(dǎo)體，對作用到腦片上的磁劑量和分布會產(chǎn)生一定影響，因為其包含生理溶液等因素的干擾，增加了磁場計算的復(fù)雜性.Comsol仿真中能夠設(shè)置溶液電導(dǎo)率、磁導(dǎo)率和密度等實際參數(shù)，通過仿真計算得到與實際所需磁場應(yīng)輸入電流大小最接近的電流值，并且從仿真結(jié)果中可以看到磁場強度和磁場強弱分布特性.

為精確定量作用于腦片上各點磁場的劑量值，對sEPSC發(fā)放特性測量提供精確的磁場刺激環(huán)境，本文采用Comsol Multiphysics中的AC/DC模塊仿真建模與計算求解.建模時，對磁場刺激器采取1×1的比例建模，設(shè)定培養(yǎng)皿中裝入空氣和ACSF兩種不同的材料，材料參數(shù)根據(jù)實際參數(shù)設(shè)置，仿真出空氣間隙磁場強度的大小和分布特性以及該磁場強度進(jìn)入溶液中的大小和分布特性，并最終針對孵育環(huán)境中腦片上磁場的定量精確分布特性展開研究.當(dāng)線圈中電流大小分別為0.105、0.20和0.42 A時，經(jīng)Comsol仿真得到暴磁區(qū)磁場強度為0.5、1和2 mT的磁場分布狀況，進(jìn)而確定腦片區(qū)的磁場分布特性，結(jié)果如圖2所示.

圖2 腦片區(qū)磁場強度的分布圖Fig.2 Distribution of magnetic field intensity in brain area

根據(jù)離體海馬區(qū)膜片鉗實驗，選擇溶液中間直徑1 cm圓形區(qū)為腦片區(qū)，由于實驗所用的腦片厚度范圍在350～500 μm，考慮到溶液中磁場在此厚度內(nèi)的強度或分布性相差很小，且小尺度模型在Comsol畫網(wǎng)格時大大增加了自由度數(shù)量，增加求解過程和時間，所以本文采取截面形式進(jìn)行分析.圖上方0.5、1和2 mT數(shù)值表示舌面處磁場強度大小.對比圖2（a）和圖2（b）可以看出，磁場在鐵芯舌面處的磁場強度是腦片上磁場強度的125倍左右，且磁場在溶液中分布更加均勻.

2 腦片s EPSC發(fā)放特性的測量

膜片鉗技術(shù)是測量腦片或細(xì)胞電生理特性的主要方法，具有高精度高穩(wěn)定性的特點.本文通過建模仿真得到實驗所需的準(zhǔn)確磁場刺激強度，在此磁場強度刺激下通過膜片鉗技術(shù)記錄腦片的sEPSC，分析磁場刺激對sEPSC發(fā)放特性的影響.

2.1 膜片鉗實驗

本實驗采用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院所屬放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供的SD（Sprague Dawley）大鼠[11]，鼠齡18～25 d，雄性.并根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法配置ACSF、切片液和全細(xì)胞記錄sEPSC電極內(nèi)液.對大鼠進(jìn)行斷頭取腦，置于0～4°C的ACSF中1～2 min，取出后置于震動切片機上切成350 μm厚的腦片.室溫下，將腦片放入ACSF中，并通入95%O2+5%CO2混合氣體，孵育45 min[13].孵育后，在顯微鏡下選取活性較好的腦片進(jìn)行磁場刺激.

準(zhǔn)備好磁刺激裝置并設(shè)定磁刺激器暴磁區(qū)的磁場強度（0、0.5、1和2 mT），將培育好的腦片放入培養(yǎng)皿中，并移到刺激器的暴磁區(qū).實驗中腦片分為4組，分別是對照組（0 mT）和工頻磁場刺激實驗組（0.5、1和2 mT），10片一組，每片腦片上取活性最好的4個神經(jīng)細(xì)胞來做實驗，每組實驗磁場暴露20 min.經(jīng)過40 d試驗后，最終得到142個有sEPSC發(fā)放的神經(jīng)元細(xì)胞，本文從中選取122個發(fā)放幅值較大的數(shù)據(jù)進(jìn)行論述.

在室溫下（20～23°C），利用EPC10-USB膜片鉗放大器（HEKA，德國）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，通過Pulse軟件設(shè)定好實驗參數(shù)、刺激波形及數(shù)據(jù)采集.采用Minianalysis軟件和Origin8.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù).數(shù)據(jù)經(jīng)P/N漏減處理后，進(jìn)行統(tǒng)計與分析，結(jié)果用Means±SD表示.差異顯著性檢驗采用單因素方差（one-way ANOVE）分析，post-hoc檢驗采用Scheffe檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001為顯著性的3個層次[14].

2.2 腦片sEPSC的發(fā)放特性分析

在本文試驗條件下，大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC經(jīng)0、0.5、1和2 mT磁場刺激下的波形如圖3所示，其幅值和頻率如圖4所示.

圖3 不同磁場強度刺激后sEPSC的波形Fig.3 Waveform of sEPSC by different magnetic field intensity stimulation

圖4 sEPSC的幅值和頻率Fig.4 Amplitude and frequeney of sEPSC

由圖3和圖4可知，在0.5、1、2 mT磁場強度下分別刺激20 min后，大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC發(fā)放的幅值和頻率均下降；且隨磁場劑量增高，sEPSC的幅值和頻率降低.由數(shù)據(jù)分析可知，在0.5 mT磁場刺激下，sEPSC的幅值與正常對照組相比下降2 046.37pA，降幅達(dá)到49.8%；而在1和2 mT磁場刺激下，降幅增至80.3%和98%，說明1和2 mT磁場刺激顯著抑制sEPSC發(fā)放的幅度.在頻率發(fā)放方面，0.5、1和2 mT磁場刺激下，頻率的降幅達(dá)到40%、67.3%和75.6%，同樣說明工頻磁場對海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元sEPSC的頻率發(fā)放發(fā)揮抑制作用.

根據(jù)單因素方差（one-way ANOVE）分析顯示，磁場作用明顯抑制sEPSC的幅值和頻率發(fā)放，并且均有顯著性差異（F（3，471）=137.32，P＜0.01；F（3，526）=7.031 56，P＜0.05）.2 mT磁場作用下神經(jīng)元sEPSC的幅值明顯低于對照組，通過post-hoc檢驗表明，2 mT磁場刺激后，對sEPSC幅值和頻率的抑制程度尤為顯著（F= 73.52，P＜0.001；F=5.85，P＜0.05）.說明磁場已經(jīng)影響到神經(jīng)元的活性，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞膜的電生理特性降低.

圖5所示為大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元單個sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間的發(fā)放特性.

圖5 單個sEPSC半波寬、上升時間和衰減時間的發(fā)放特性Fig.5 Issuance characteristics of half-wave w idth,rise time and decay time of single sEPSC

由圖5可知，0.5、1、2 mT磁場作用20 min后，大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元單個sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間的發(fā)放特性相似.與對照組相比，0.5和1 mT磁場作用后，sEPSC的半波寬分別上升了0.29和0.64 ms，上升時間分別上升了0.27和0.49 ms，衰減時間上升了0.4和1.0 ms.單因素方差（one-way ANOVE）分析顯示，0.5、1 mT磁場作用使sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間顯著性增加（F（2，468）= 67.49，P＜0.01；F（2，468）=20.51，P＜0.01；F（2，468）= 87.12，P＜0.01）.由此說明，磁場刺激延長了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC的發(fā)放周期，從而降低了其發(fā)放頻率，說明磁場刺激對腦片sEPSC的頻率發(fā)放有抑制作用.當(dāng)增加磁場刺激劑量至2 mT后，與對照組相比，sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間分別下降了0.63、0.79和0.3 ms，降幅達(dá)到42.3%、50.3%和23.4%. post-hoc檢驗表明，與對照組相比，2 mT磁場作用顯著抑制了sEPSC半波寬、上升時間和衰減時間的發(fā)放（F=13.19，P＜0.001；F=6.71，P＜0.001；F=25.31，P＜0.001）.在2 mT磁場刺激下，腦片上神經(jīng)元活性下降，細(xì)胞膜上離子通道活性隨之下降，細(xì)胞突觸間離子交換能力下降，因此，sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間顯著下降，說明2 mT磁場刺激顯著抑制了sEPSC的半波寬、上升時間和衰減時間的發(fā)放.

綜上所述，工頻磁場抑制海馬區(qū)神經(jīng)元sEPSC的發(fā)放特性，且隨磁場強度的增加，磁場對sEPSC幅值和頻率的抑制越來越強，隨之抑制sEPSC半波、上升時間和衰減時間特性.這可能是由于:磁場的洛侖茲力能夠影響帶電粒子的移動，因此，磁場能夠影響細(xì)胞膜的離子通透性和膜兩側(cè)的電位，導(dǎo)致機體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)外電位失衡，從而影響帶電物質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程，產(chǎn)生一些生物效應(yīng).另外，在一些生物學(xué)的系統(tǒng)里，反磁體分子以高度規(guī)則方式排列，并以平行的反磁體矢量連接發(fā)揮作用[15].低強度工頻磁場產(chǎn)生的洛倫茲力使得突觸間帶電狀態(tài)的谷氨酸和Ca2+、Na+、K+等離子非正常移動，不能與突觸后膜上相應(yīng)受體結(jié)合，從而影響到sEPSC的放電特性.本實驗結(jié)果提示，低強度磁場的生物刺激作用與細(xì)胞突觸膜離子通道特性及通道構(gòu)形變化有關(guān)，但仍需進(jìn)一步從分子生物學(xué)及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面進(jìn)行分子層面的理論和實驗驗證.

3 結(jié)束語

為了研究磁場對腦片sEPSC電生理特性的生物刺激作用，本文設(shè)計了適用于離體腦片實驗的50 Hz、0～100 mT磁信號發(fā)生器，通過實際測量、理論公式計算及Comsol建模仿真，得到磁場刺激器暴磁區(qū)的磁場強度和分布，最終確定作用到腦片上的磁場強度大小及分布情況.在此基礎(chǔ)上，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，針對大鼠海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元細(xì)胞，記錄由工頻磁場誘發(fā)的sEPSC幅值及發(fā)放頻率，在細(xì)胞水平上研究工頻磁場對興奮性突觸后電流傳遞的影響.以sEPSC的幅值、頻率、半波長、上升時間和衰減時間為指標(biāo)，研究工頻磁場抑制興奮性突觸傳遞的可能機制.結(jié)果表明:在0.5和1 mT磁場刺激下，神經(jīng)元sEPSC的頻率和幅值均有大幅度的下降，半波長、上升時間和衰減時間均高于未經(jīng)過磁場刺激的神經(jīng)元，說明細(xì)胞的興奮性傳遞頻率明顯降低；當(dāng)磁場強度達(dá)到2 mT時，神經(jīng)元sEPSC的幅值、頻率、半波長、上升時間和衰減時間顯著下降.

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Effects of low intensity power frequency magnetic field on payment feature of hippocampal sEPSC in vitro brain slices

WANG Jin-hai1，2，DU Zheng-gao1，ZHENG Yu1，2，KONG Ying1，HONG Hui1，QIU Qian1
（1.School of Electronics and Information Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China；2.Center of Tianjin Medical Electronic Engineering Technology，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

In order to investigate the biological stimulation of the magnetic field on the hippocampal spontaneous Excitatory Postsynaptic Current（sEPSC）of the brain slices，the actual measurement，mathematical modeling and Comsol software simulation were used to model and simulate a typical magnetic stimulation device,the magnetic field intensity and distribution characteristics of the exposed area were confirmed.And the hippocampal sEPSC in the vitro brain slices under the magnetic field was studied with the patch clamp experiment.The results showed that the magnetic field intensity decreases by 125 times from the simulator to the brain slice，and the magnetic field distributes uniformly in physiological solution.The higher the magnetic field dose，the lower the amplitude and frequency of sEPSC.When the magnetic field intensity reaches 2 mT，the amplitude，fequency，half-wave width，the rise time and decay time of neuron sEPSC decrease significantly.This results illustrated that with the increase of intensity of magnetic field，the magnetic field suppresses the sEPSC release.

exposure to power frequency magnetic；magnetic field intensity；distribution characteristics；hippocampus in vitro brain slices；spontaneous Excitatory Postsynaptic Current（sEPSC）；payment feature

Q689；TP391.9

A

1671－024X（2015）04－0052－06

10.3969/j.issn.1671-024x.2015.04.011

2015-04-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（61201106）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410058027）

王金海（1966—），男，博士，教授，研究方向為生物信息提取.E-mail:wangjinhai@tjpu.edu.cn