蔣麗艷 于智浦 宋波

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學(xué)特征之一，也是癌癥患者死亡及遠期療效差的主要因素[1]，是一個多分子參與的極為復(fù)雜的過程[2]，細胞黏附為關(guān)鍵步驟之一，黏附過程涉及選擇素（selectin）、整合素（integrin）、鈣黏素（cadherin）等多種黏附分子[3]。P-選擇素是細胞黏附分子家族的重要成員之一，在介導(dǎo)多種腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞間的黏附起了非常重要的作用[4-5]。因此，抑制P-selectin表達可能是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法[6]。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本實驗室從狼毒大戟根部新發(fā)現(xiàn)并提取的低分子多糖化合物[7]，課題組前期研究證明其能夠抑制人大細胞肺癌細胞NCI-H460與人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs的黏附，本試驗以TNF-α誘導(dǎo)HUVECs 建立內(nèi)皮細胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞P-selectin表達的影響，探討EFP-AW1是否能夠通過降低P-selectin的表達而抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 狼毒大戟購買于齊齊哈爾市藥材公司，EFP-AW1為本實驗室從中藥狼毒大戟中新發(fā)現(xiàn)并分離提取的低分子多糖化合物[7]，分子量為10.830 Da；人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs購于美國ATCC細胞庫；用于培養(yǎng)細胞的RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FCS）均為HyClone產(chǎn)品；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購于R&D公司。FITC標記的P-selectin鼠抗人單克隆抗體（BD公司）；Trizol（TaKaRa公司）；SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，補充100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置于5%CO2，37 ℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞鋪滿瓶壁80%~90%傳代，取5~6代的細胞用于實驗，并將細胞分為五組，分別為空白對照組、TNF-α刺激組、EFP-AW1低劑量組、EFP-AW1中劑量組、EFP-AW1高劑量組。實驗組細胞分別加入不同劑量EFP-AW1（5、10 μg/mL和20 μg/mL），作用48 h后，除空白對照組外均加入10 ng/mL TNF-α，37 ℃刺激2 h，收集細胞進行以下實驗。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測EFP-AW1對HUVECs細胞P-selectin蛋白表達的影響 收集1×106個HUVECs細胞，PBS洗2次，加入FITC標記的P-selectin鼠抗人單克隆抗體（CD62P）20 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次，加入PBS重懸細胞，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀檢測。以上實驗重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR 檢 測 TNF-α 誘 導(dǎo) 的 HUVECs細 胞P-selectin mRNA表達 利用Trizol試劑提取細胞總RNA。在20 μL RT反應(yīng)體系中，取各組細胞總RNA 1 μg為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以4 μL逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板進行PCR循環(huán)。PCR反應(yīng)引物序列如下：P-selectin 正向引物：5'-CAA TCA CTT TTA GCC AAA TATC-3'；反向引物5'-TTA TAA TTC AGC AAC CTG AAC TG-3'；β-action上游為：5'-AAG GAT TCC TAT GTG GGC -3'，下游為5'-CAT CTC TTG CTC GAA CTC-3'[8]。按說明書設(shè)置PCR擴增條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；57 ℃，30 s；共 40 個循環(huán)。ABI7300熒光定量PCR儀進行PCR反應(yīng)。采用相對定量法，根據(jù)下列公式按Ct值計算各基因的相對表達量：基因的相對表達量=2-△△Ct[注：△△Ct=（Ct目的基因-Ct對照基因）-（Ct內(nèi)參目的基因-Ct內(nèi)參對照基因）]

2 結(jié)果

2.1 EFP-AW1對活化HUVECs細胞表面P-selectin蛋白表達的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明（圖1），TNF-α刺激HUVECs后，HUVECs黏附分子P-selectin表達明顯上升（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高劑量組對TNF-α刺激的HUVECs P-selectin表達的上升均具有抑制作用（P<0.05）。

2.2 EFP-AW1對活化HUVECs細胞P-selectin mRNA表達的影響 根據(jù) 2-△△Ct值，計算各組 P-selectin 相對 mRNA 表達量，實驗結(jié)果顯示（圖2）：TNF-α 刺激組HUVECs P-selectin 2-△△Ct值顯著高于空白對照組（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高劑量組2-△△Ct值與TNF-α 刺激組比較顯著降低（P<0.05），表明EFP-AW1能夠下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs黏附分子P-selectin mRNA表達。

圖1 EFP-AW1對活化HUVECs P-selectin蛋白表達的影響*與TNF-α組比較，P<0.05

圖2 EFP-AW1對活化HUVECs P-selectin mRNA表達的影響*與TNF-α組比較，P<0.05

3 討論

腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞間相互作用是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[9-10]。在轉(zhuǎn)移過程中，多種黏附分子發(fā)揮重要作用。黏附分子以配體（Ligand）-受體（Receptor）相對應(yīng)的形式發(fā)揮作用，介導(dǎo)細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間或細胞-基質(zhì)-細胞之間的黏附，參與腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程[11-12]。P-selectin是黏附分子家族的重要成員之一，Aigner等[13]報道腫瘤細胞能夠通過其表面的P-selectin糖蛋白配體黏附到內(nèi)皮細胞表面P-selectin上，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞的黏附作用。已證實P-selectin能夠和多種人類腫瘤細胞結(jié)合，如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、胃癌、舌鱗狀細胞癌等[14]。因此，抑制內(nèi)皮細胞P-selectin的表達是抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療中的一個潛在靶點。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本實驗室從狼毒大戟根部新發(fā)現(xiàn)并提取的低分子多糖化合物[7]，課題組前期研究證明其能夠抑制人大細胞肺癌細胞NCI-H460與人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs的黏附。靜止的內(nèi)皮細胞不表達或低表達P-selectin，當其受到組胺、凝血酶、TNF-α及LPS等激活后，可使已儲存的P-selectin于數(shù)分鐘內(nèi)在細胞表面表達[15]。本試驗以TNF-α誘導(dǎo)HUVECs建立內(nèi)皮細胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞P-selectin表達的影響，探討EFP-AW1是否能夠通過降低P-selectin的表達而抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附。研究結(jié)果表明，低、中、高劑量的EFP-AW1均可從核酸和蛋白水平抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞表達P-selectin（P<0.05），并具有一定的劑量依賴性。表明EFP-AW1可能通過降低內(nèi)皮細胞表面P-selectin的表達而抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，從而具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在價值。

[1]韓彬，羅麗萍，陳祥燕，等.花青素抑制腫瘤轉(zhuǎn)移研究進展[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，8（1）：107-110.

[2]李媛，丁蘭.P-選擇素與腫瘤轉(zhuǎn)移[J].西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，44（3）：78-80.

[3]李璘，朱荃，陸茵.粘附分子與腫瘤轉(zhuǎn)移[J].中國藥理學(xué)通報，2007，23（5）：568-571.

[4]宮亮.血小板活化表達P-選擇素對原發(fā)性肺癌血行轉(zhuǎn)移的影響及機制研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[5]姜宇.化學(xué)修飾肝素抑制P-選擇素介導(dǎo)的乳腺癌細胞粘附作用分子機制的研究[D].長春：東北師范大學(xué)，2009.

[6]岳麗玲，李成沖，周麗，等.LMPAB對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞E-selectin表達和細胞粘附的影響及其機制[C].中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集，2010.

[7] Liu Jicheng， Sun Yongxu， Liu Lei， et al.A water-soluble polysaccharide（EFP-AW1） from the alkaline extract of the roots of a traditional Chinese medicine， Euphorbia fischeriana：Fraction and Characterization[J].Carbohydrate Polymer， 2012， 87（3）：1299.

[8] Vora D K，Rosenbloom C L，Beaudet A L， et al.Polymorphisms and linkage analysis for ICAM-1 and the selectin gene cluster[J].Genomics，1994，21（3）：473-477.

[9] Kannagi R，Izawa M，Koike T，et al.Carbohydrate-mediated cell adhesion in cancer metastasis and angiogenesis[J].Cancer Sci， 2004，95（5）：377-384.

[10] Song G， Ohashi T， Sakamoto N， et al.Adhesive force of human hepatoma HepG2 cells to end-othelial cells and expression of E-selectin[J].Mol Cell Biomech， 2006， 3（2）：61-68.

[11] Biancone L， Araki M， Araki K， et al.Redirection of tumor metastasis by expression of E-selectin in vivo[J].J Exp Med，1996， 183（2）：581-587.

[12]谷化平，尚培中，周翠玲.唾液酸化的路易斯-X抗原和E-上皮鈣粘附素與乳腺癌預(yù)后[J].中國臨床康復(fù)，2003，7（14）：2034-2036.

[13] Aigner S， Ramos C L， Hafezi-Moghadam A， et al.CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selecin[J].FASEB J，1998，12（12）：1241-1251.

[14] Ludwig R J，Alban S，Bistrian R，et al.The ability of different forms of heparins to suppress P-selectin function in vitro correlates to their inhibitory capacity on bloodborne metastasis in vivo[J].Thromb Haemost，2006，95（3）：535-540.

[15] Matsui N M， Varli A， Embury S H.Heparin inhibits the flow adhesion of sickle red blood cells to P-selectin [J].Blood，2002，100（10）：3790-3796.